左旋18-甲基炔诺酮对大鼠垂体黄体生成素细胞形态及血清浓度的影响

黎海莉，杜 鹃，刘雅坤，刘晓云，康 林*，崔慧先

（1.河北医科大学第四医院妇产科，河北石家庄050011；2.河北医科大学基础医学院人体解剖学教研室，河北石家庄050017）

·论 著·

左旋18-甲基炔诺酮对大鼠垂体黄体生成素细胞形态及血清浓度的影响

黎海莉1，杜 鹃2，刘雅坤1，刘晓云2，康 林2*，崔慧先2

（1.河北医科大学第四医院妇产科，河北石家庄050011；2.河北医科大学基础医学院人体解剖学教研室，河北石家庄050017）

目的分析左旋18-甲基炔诺酮（levonorgestrel，LNG）对大鼠垂体黄体生成素（luteinizing hormone，LH）细胞形态和血清浓度的影响。方法应用免疫组织化学方法结合计算机图像分析，观察应用LNG后大鼠垂体LH细胞的变化，同时应用自动化学发光免疫分析仪测定血清LH浓度。结果短期实验组大鼠LH细胞形状变圆（P＜0.05），灰度加深（P＜0.05），而细胞数量和平均面积无明显改变（P＞0.05）；长期实验组大鼠LH细胞形状不规则，细胞数量和平均面积减少（P＜0.01）；短期和长期实验组大鼠血清LH浓度均下降（P＜0.01）；停药后LH细胞数量，平均面积及血清LH浓度逐步恢复正常（P＜0.01）。结论应用LNG可以引起大鼠垂体LH细胞形态及血清LH浓度的改变，但这一过程是可恢复的。短期应用主要作用部位在垂体前叶。长期应用同时抑制了下丘脑GnRH的合成与分泌，从而抑制排卵。

甲基炔诺酮；垂体；黄体激素类；大鼠

单纯孕激素口服避孕药，对哺乳期妇女和想使用口服形式避孕的妇女，是一种很好的避孕方法［1-2］。目前，涉及下丘脑-垂体-卵巢轴反馈调节机制的研究报道多集中于生殖药理学、生化学与临床研究方面［3-4］，缺乏单纯孕激素避孕药对下丘脑-垂体-卵巢轴反馈调节的形态学资料。在单纯孕激素避孕药左旋18-甲基炔诺酮（levonorgestrel，LNG）的长期作用下，大鼠下丘脑促性腺激素释放激素（gonadotroPin-relasing hormone，GnRH）阳性神经元形态发生改变：光密度减低；棘型GnRH神经元减少，棘突触数量减少，纤维膨体数下降，长期应用LNG，可使下丘脑GnRH神经元的功能处于非活跃状态［5］。我们还证实下丘脑神经肽Y神经元参与了LNG长期作用下GnRH分泌的调节［6］，同时下丘脑弓状核、下丘脑腹内侧核雌激素受体也参与了这一反馈调节过程［7］。但是在垂体水平，LNG对黄体生成素（luteinizing hormone，LH）细胞形态及血清LH的影响还未见报道。本文应用免疫组织化学并结合计算机图像分析技术对大鼠应用LNG后垂体LH细胞的形态学变化以及血清LH浓度的变化，进行了观察、分析和初步探讨，以期为临床避孕药物的应用提供形态学资料。

1 材料与方法

1.1 动物及分组：健康成年雌性SD大鼠36只，体质量200～250g（河北省实验动物中心提供），自然光照、室温（22±3）℃、自由饮食饮水饲养。大鼠随机分为对照组与实验组，实验组大鼠分为短期实验组7只（喂药20d），长期实验组7只（喂药90d）和停药实验组7只（停药后继续普通喂养20d）。实验组大鼠每天上午9时左右灌胃服用溶于食用麻油的LNG 50mg·kg-1·d-1，对照组（15只）灌服等量食用麻油。

1.2 取材及切片：依据阴道涂片结果分别将处于动情期的实验组及其相应对照组的大鼠称质量，心脏取血后迅速使用4%多聚甲醛经主动脉行灌流固定，静置1h。所取心脏血样，室温下低速离心（2 000r/min）20min，-20℃备用待测。取垂体入Bouin液固定12h，常规脱水透明，石蜡包埋，用组织切片机从垂体头侧向尾侧做冠状连续切片，片厚4μm，切片裱于涂有多聚赖氨酸的载片上。每例垂体连续集片于10组载玻片（同一载玻片相邻两张切片间隔40μm）（图1A，B），入37℃温箱内干燥24h，备用。

1.3 免疫组织化学法：常规石蜡切片脱蜡至水、依次进入0.01mol/L磷酸盐缓冲液（PBS，PH7.4），3%过氧化氢（甲醇稀释）常温孵育，10%正常山羊血清、豚鼠抗大鼠β-LH单克隆抗体（协和医科大学提供，PBS 1∶7 000稀释），4℃冰箱过夜。生物素标记的1∶100兔抗鼠IgG（北京中山生物技术有限公司提供），37℃温箱、湿盒内孵育30min。1∶100辣根过氧化物酶的链霉卵白素（北京中山生物技术有限公司提供），37℃温箱、湿盒内孵育30min。用DAB-H2O2显色3min，自来水停显、脱水、透明、中性树胶封固（图1C，D）。

1.4 计算机图像分析：根据大鼠垂体冠状切面上前叶、中间叶和后叶出现的形态学特征，每只大鼠分别在垂体头端部、中间部和尾端部选择典型切片各1片。具体标准为，头端部，神经叶和中间叶等宽处；中间部，神经叶最宽处；尾端部，神经叶刚消失，只剩中间叶和前叶组织处。应用ZL-2000型计算机图像分析系统，在相应切片上分别对单位视野内（0.01mm2）LH细胞的数量及其面积，平均灰度和形状等参数进行测定。

1.5 血清LH浓度测定：应用美国德普公司自动化学发光免疫分析仪（IMMULITE系统）及原装试剂盒测定血清LH浓度。该方法是一种固相、双位点、化学发光免疫测量法，固相为聚乙烯珠，包被有抗所测激素的特异性单克隆抗体，与血中激素结合后再与碱性磷酸酯多克隆抗体形成复合物，加入化学发光底物，通过温控光度计测量光子量，应用计算机内存Master's曲线计算结果。

1.6 统计学方法：应用SAS8.0统计软件进行分析，计量资料以±s表示，比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

垂体HE染色切片光镜观察，可见腺细胞排列成不规则的索和团状，少数成滤泡状，细胞间有丰富的窦状毛细血管（图1B）。大鼠腺垂体LH免疫反应阳性细胞的胞质呈浅褐色，细胞呈圆形或卵圆形，细胞核为圆形或椭圆形，常位于窦状毛细血管附近，在大鼠垂体头端部的腹侧区，头端部和尾端部的背侧区及邻近中间叶的两侧翼数量多（图1D），胞体较大（图2A）。我们应用计算机图像分析系统，对垂体单位视野内LH细胞的数量及其面积、平均灰度和圆形度等参数进行了测定。

2.1 LNG对大鼠LH细胞面积的影响：短期实验组LH细胞面积（149.6±16.54）μm2和停药实验组（151.27±33.38）μm2，与各自对照组（151.45± 18.41）μm2、（160.93±22.81）μm2相比（图2），差异无统计学意义（P＞0.05）。长期实验组（124.85±22.27）μm2与长期对照组（163.72± 24.97）μm2相比，细胞面积减小，差异有统计学意义（P＜0.01）。各实验组间纵向比较，长期实验组细胞面积最小，与短期实验组和停药实验组相比差异有统计学意义（P＜0.01）。

2.2 LNG对大鼠LH细胞数量的影响：单位视野内LH免疫反应阳性细胞的数量，长期实验组（7.44± 1.21）个，少于长期对照组的（9.42±0.42）个（图2），差异有统计学意义（P＜0.01）；停药实验组（8.60±0.45）个，少于停药对照组的（9.02±0.33）个，差异有统计学意义（P＜0.05）。各实验组间纵向比较，长期实验组细胞数目最少，分别与短期实验组和停药实验组相比，差异有统计学意义（P＜0.01）。

2.3 LNG对大鼠LH细胞平均灰度的影响：短期实验组56.83±3.63与短期对照组61.49±3.94相比，细胞灰度加深（图2），差异有统计学意义（P＜0.05）。长期实验组58.33±2.81和停药实验组60.06±3.37与各自对照组60.43±3.74、60.19± 2.27相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.4 LNG对大鼠LH细胞形状的影响：细胞形状用圆形度定量描述截面形态和圆的相差程度，若细胞截面为圆时，圆形度为1，当截面非圆时，圆形度＜1，界面越不规则，圆形度越小。LH细胞的圆形度，短期实验组0.75±0.015与短期对照组0.72± 0.014相比，形状变圆（图2），差异有统计学意义（P＜0.01）。长期实验组0.70±0.035与长期对照组0.71±0.015相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。停药实验组0.69±0.04与停药对照组0.71±0.012相比，细胞形状不规则，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.5 LNG对大鼠血清LH浓度的影响：短期实验组（183.9±14.77）mU/L、长期实验组（177.76± 9.95）mU/L与短期对照组（212.48±16.33）mU/L、长期对照组（215.42±13.80）mU/L相比，血清LH浓度下降，差异有统计学意义（P＜0.01）。停药实验组（204.36±14.50）mU/L与停药对照组（209.36±9.91）mU/L相比，差异无统计学意义（P＞0.05），而与长期实验组相比，血清LH浓度上升，差异有统计学意义（P＜0.01）。

3 讨 论

正常的排卵依赖于下丘脑-垂体-卵巢轴的精密调控。其中，下丘脑分泌的GnRH对垂体的影响有2种效应。首先，GnRH能促进LH的合成与释放。其次GnRH能在LH第2次作用于垂体前叶时，使其释放更容易，LH峰值也明显高于第1次［8-9］。而孕酮则可降低此反应，使LH分泌下降，这可能与孕激素降低垂体雌激素受体数目有关［7］。这种反应还同血中雌、雄激素水平有关。正常动情周期中，在促性腺激素的作用下，卵泡逐步生长、成熟，使内源性雌激素水平逐步升高。雌激素水平升高可触发和增强GnRH对垂体的效应，并使大鼠垂体GnRH受体数量增加，从而激发LH、FSH分泌高峰，引起排卵。雄激素则表现出抑制作用，睾酮能与垂体雄激素受体结合，直接抑制LH分泌［10］。

LNG是第2代全合成孕激素类药物，为19-去甲基-睾酮的衍生物，19位甲基被取代，17位增加乙炔基，是强有力的孕激素，并具有一定雄激素和抗雌激素活性。本实验观察到短期应用LNG后，圆形LH细胞明显增多，细胞的平均灰度加深，血清LH浓度下降。这表明激素分泌减少，分泌颗粒在细胞内聚集，使细胞变圆，免疫阳性反应加强。由此可以认为，短期应用LNG后，LH细胞内仍有少量激素合成，并形成分泌颗粒。

本实验结果显示，长期应用LNG后，垂体LH细胞形状不规则，细胞变小，数量减少，血清LH浓度下降。其主要原因可能是GnRH水平下降或其分泌的脉冲频率、幅度的改变，导致LH的合成与分泌处于停滞。由于细胞质内无LH形成，LH分泌颗粒很少，甚至用较敏感的SP免疫组织化学方法也不能显示，表现为免疫反应阳性细胞变小，数量减少。本实验结果表明，短期应用LNG达到抑制排卵的作用是多环节的，其关键作用部位在垂体前叶。而长期应用LNG是抑制了下丘脑GnRH的合成与分泌［2-3］，其具体机制还需进一步研究。

本实验观察到，停药后大鼠垂体LH细胞的形态、细胞的分布及大小均逐渐接近正常情况，血清LH浓度也逐步恢复正常水平。应用LNG对腺垂体细胞形态和内分泌活动的影响是暂时的，停药后可逐渐恢复正常。LNG是一安全、高效、可逆的孕激素类避孕药物。（本文图见封二）

【参考文献】

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［2］BURKE AE.The state of hormonal contracePtion today：benefits andrisksofhormonalcontracePtives：Progestin-only contracePtives［J］.Am J Obstet Gynecol，2011，205（4 SuPPl）：14-17.

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［6］刘晓云，崔慧先，刘力斗，等.LNG对大鼠下丘脑内NPY神经元的影响［J］.基础医学与临床，2006，26（11）：1266-1267.

［7］刘力斗，刘晓云，卜晖，等.左旋18-甲基炔诺酮对大鼠雌激素水平及下丘脑雌激素受体阳性细胞的影响［J］.解剖学杂志，2008，31（2）：162-165.

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［9］BANGA FR，HUIRNE JA，ORSEN TK，et al.Pituitary sensitizing effect of GnRH antagonists：a mechanism exPlaining LH escaPe during IVF［J］.Hum ReProd，2010，25（6）：1513-1519.

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（本文编辑：赵丽洁）

THE EFFECTS OF LEVONORGESTREL ON THE MORPHOLOGICAL CHANGE OF THE PITUITARY LH CELLS AND SERUM LH LEVEL IN RATS

LI Haili1，DU Juan2，LIU Yakun1，LIU Xiaoyun2，KANG Lin2*，CUI Huixian2
（1.Department of Obstetrics and Gynecology，the Fourth Hospital of Hebei Medical University，Hebei Province，Shijiazhuang 050011，China；2.Department of Anatomy，the School of Basic Medical Sciences，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China）

ObjectiveTo investigate the morPhological alternations of Pituitary luteinizing hormone（LH）cells and the serum concentrations of levonorgestrel（LNG）-treated rats.MethodsThe Pituitary LH cells were identified by immunohistochemistry and comPuter images analysis system.The serum concentrations of LH were measured by IMMULITE automated analyzer.ResultsIn short-term treated grouP，the shaPe of LH cells became round（P＜0.01）and the gray level（P＜0.05）of LH cells increased，while the number and mean area of LH cells had no significant difference as comPared with that in control grouP（P＞0.05）.In long-term treated grouP，the number and mean areas of LH cells decreased（P＜0.01）and the shaPe became irregular.The serum concentrations of LH were significantly lower in treated grouP than those of control grouP in both terms（P＜0.01）.After ceasing treatment，these changed features recovered to normal gradually（P＜0.01）.ConclusionLNG caused changes of morPhology of LH cells and concentrations of LH in serum，but these changes can return to normal afterceasing treatment.The decrease of the Pituitary resPonse to GnRH caused by short-term treatment of LNG Play an imPortant role on antiovulation，while long-term effects PerhaPs also involve central mechanisms such as influence on hyPothalamus，making synthesis and release of GnRH decrease.

norgestrel；Pituitary；corPus luteum hormones；rats

R979.21

A

1007-3205（2012）05-0497-04

2012-02-02；

2012-04-05

河北省科技厅博士基金课题（04547002D-3）

黎海莉（1974-），女，河北邯郸人，河北医科大学第四医院副主任医师，医学博士，从事生殖内分泌学以及妇科肿瘤诊治研究。

*通讯作者

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.05.001