Smac过表达与促进肿瘤细胞凋亡的关系

冯 为,曹洪涛,廖 明

(1.佳木斯大学附属第一医院普外科,黑龙江 佳木斯 154003;2.佳木斯市中心医院胸外科,黑龙江佳木斯 154002)

Smac是第二种线粒体来源的 caspase激活剂,又称低等电点 IAP结合蛋白,位于线粒体内,在凋亡信号的刺激下,随着细胞色素 C被释放入细胞浆,通过与 IAPs结合发挥促凋亡作用。

肺癌是世界上常见的高发肿瘤之一。世界范围内,每年发现的肺癌患者高达135万例,其中约118万位患者因此死亡[1]。近年来,国内发病率呈递增趋势,目前已占男性恶性肿瘤的首位。由于诊断技术的局限性以及无特异性临床表现,超过70% 的患者就诊时已经存在转移性疾病,从而不适宜手术治疗,这些患者主要采取以化疗为主的综合治疗。化疗能够延长生存期,但是化疗药物伴随严重的毒副作用,对患者组织细胞损害大;不仅如此,化疗药物易引起肿瘤多耐药性(multiple drug resistance,M DR),是患者化疗效果有限的主要原因之一。

多细胞生物中存在两种细胞清除机制:坏死和凋亡[2]。细胞凋亡是一种更为清洁、自然的细胞死亡方式。研究表明,细胞正常凋亡的破坏部分是由凋亡相关蛋白的异常表达或突变引起的。凋亡受阻将引发肿瘤发生及药物耐受。因此,深刻理解肺癌细胞中凋亡诱导的机制对于抗癌药物的研发和肺癌治疗尤为重要。在这篇综述中,我们主要讨论肺癌细胞中凋亡信号转导途径以及与凋亡抑制相关的因素。

1 细胞凋亡的主要途径

在哺乳动物细胞中,细胞凋亡的发生主要包括两种不同的信号途径:(1)外在途径,由死亡受体的识别引发 ,随后激活 caspase-8;(2)内在途径,起始于细胞应急反应,激活caspase-9[3]。这些不同的细胞凋亡信号转导途径最终在凋亡的执行阶段实现汇聚,即激活 caspase-3和 /或 caspase-7。

1.1 细胞凋亡的外在途径

在死亡受体途径或外在凋亡途径中,受体位于细胞膜上,由胞外配体结合并激活。比较有代表性的死亡受体包括成纤维细胞相关抗原受体即 Fas/CD95受体,肿瘤坏死因子受体 1,DR3、DR4和 DR5,它们属于肿瘤坏死因子家族。前 3种受体相应的配体分别为 FasL、TN F、APO-3L,后两种配体均为 TRAIL。

1.2 细胞凋亡的内在途径

细胞凋亡的内在途径又称为线粒体途径,它由胞内或胞外的凋亡刺激信号所激活,这些因素包括氧化应激、辐射、DN A损伤以及细胞毒性药物等[4]。与死亡受体依赖途径不同,线粒体依赖途径起始于线粒体膜:Bax/Bak蛋白插入线粒体膜,随后线粒体内膜释放细胞色素 C进入胞质。释放入胞质的细胞色素 C被招募至凋亡酶激活因子-1(Apaf-1)附近,组装成一个二元复合物。在 ATP或 dAT P存在的情况下 pro-caspase-9即 caspase-9的前体物与细胞色素 C、Apaf1组装成一个三元复合体,称为凋亡体。大小约为700 kBa-1.4 mBa[5]。Pro-csapase-9通过它的 caspase募集结构域 CARD与 Apaf1结合,两分子的 csapase-9酶原相互剪切而活化。活化的 caspase-9作为线粒体依赖的凋亡途径的起始者,随后激活下游的凋亡执行者 caspase-3,从而开启蛋白水解的级联反应,最终导致细胞死亡。

2 Caspases蛋白家族与凋亡

尽管细胞凋亡的分子机制尚不完全清楚,但是已有的研究表明 caspases即半胱氨酸蛋白酶是细胞凋亡过程中的核心环节和关键步骤。

Caspase全称为含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶,它们的活性位点均包含半胱氨酸残基,能够特异性的切割靶蛋白天冬氨酸残基后的肽键。Caspase-1是最早被发现的caspase家族蛋白,它与新杆状线虫中发现的能促进凋亡的CED-3蛋白同源[7]。并非所有的 caspase都参与细胞凋亡过程,大多数 caspase除参与细胞凋亡执行外 ,还参与到细胞存活、增值、分化或炎症反应等多个过程。

2.1 Caspase的活化机制

细胞中合成的 caspase在发挥活性之前以单链的无活性的酶原形式存在,包含四个结构域:N端长度可变的prodomain区,分子量分别为 20kD和10kD的大小亚基,以及连接两个催化性亚基的铰链区(有些家族成员中缺少铰链区 )。Caspase前体活化时,两个大小亚基间的连接区被自身剪切,结果产生了由两个大亚基和两个小亚基组成的异源四聚体,即具有活性的酶。Caspase家族成员 N端 prodomain区长短不一,较长的 prodomain由至少90个氨基酸残基组成,内含能与接头蛋白相互作用的调控区,这些调控区具有 DED或 CARD功能域。DED-DED识别负责疏水蛋白相互作用,而 CARD-CARD接触引发静电相互作用。

根据其促凋亡功能,caspase蛋白家族分为两类:一类为引发器(initiator),即凋亡的起始者,包括 caspases-2,-8,-9,-10,-11;另一类为效应器(effector),或称为凋亡执行者,包括 caspases-3,-6,and-7。引发器 caspase在外来蛋白信号的作用下被切割激活,活化的引发器 caspase负责切割并激活下游的效应器 caspase蛋白。效应器 caspase蛋白能够直接水解多种底物,包括细胞核、细胞质以及细胞骨架中的结构和调控蛋白[8]。在某些情况下,如凋亡起始信号较弱时,引发器 caspase也可以行使效应器 caspase的功能,这将有助于放大凋亡信号。此外,效应器 caspase也可以由其它的非 caspase蛋白酶激活,如组织蛋白酶、钙蛋白酶和粒酶。这些 caspase蛋白水解信号级联系统相互交联,最终导致凋亡信号被显著放大。

2.2 Caspase抑制剂

由于 caspase在细胞凋亡过程中发挥关键性作用,它们大多与癌细胞无限增殖密切相关。因此,有效控制 caspases的激活和抑制已成为癌症治疗的一个重要方向。

研究发现,caspase蛋白家族在恶性肿瘤中发生突变的几率较高[9]。在肿瘤细胞中,恢复 procaspase-3表达能够增加抗癌药物敏感性。另一方面,通过反义 RN A阻断一些caspase的表达能够使肿瘤细胞对一些经典的化疗药物敏感性增加。类似的工作有助于我们更好地理解 caspase级联放大效应的激活机制,从而为设计直接靶向 caspase激活机制而又不引起正常细胞应激反应的的抗癌药物研发带来新的希望。

3 Smac在肿瘤发生发展中的作用

人类 Smac最初由王晓东实验室在 Hela细胞中发现,位于第12条染色体的长臂,由7个外显子组成。初始编码的Smac由239个氨基酸组成,其氨基末端有一段特殊的由55个氨基酸残基组成的序列,称为线粒体靶向序列(mitochondrial targeting signal,M TS)。当胞浆中的 Smac蛋白被转运到线粒体后,MTS被剪切掉,生成含有184个氨基酸残基的成熟蛋白,以二聚体的形式存在于线粒体膜间隙。在凋亡信号刺激下,成熟的 Smac/DABLO释放进入细胞质。在胞质中,Smac通过与 IAPs形成同二聚体而相互作用,促进 caspase活化,从而发挥促凋亡作用[11]。Smac能够与 XIAP的 BIR2和 BIR3结构域结合,使 XIAP无法发挥凋亡抑制作用,从而使得 caspase-3和 caspase-9得以释放。其中,caspase-9的 N末端有一个与 Smac类似的四肽基序,因此能够和 Smac竞争结合 XIAP的 BIR3结构域;caspase-3的释放则是 Smac的 N末端基序与 X IAP的 BIR2结构域结合的缘故。

因为 Smac在肿瘤细胞化疗敏感性方面扮演重要角色,所以对于 Smac表达水平是否与癌症演进过程呈负相关就显得非常有必要,相关研究将为有望使 Smac成为癌症预后或治疗的靶标。对肾细胞癌的研究发现,Smac mRN A及蛋白表达水平与肿瘤进展水平负相关[12]。此外,术后 Smac表达水平高的肾细胞癌患者生存时间也相应高于 Smac低表达的患者;Smac低表达患者死亡概率要比高表达患者高四倍[13]。与此相似,Sekimura等在肺癌患者中也发现了 Smac表达水平明显下降的现象[14]。由于非小细胞肺癌中 IAPs表达水平会上调,因此 Smac表达降低将使得凋亡更难进行。进一步的研究发现,临床三期患者 XIAP/Smac比值明显高于一期和二期患者。

因此有望通过构建表达成熟型 Smac的重组质粒作用于肺癌患者,加入化疗药物紫杉醇作为凋亡诱导信号有望为肺癌的治疗提供新的思路。

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