HBV逆转录酶区181位点变异研究进展

2012-04-12 09:42李平综述汪茂荣审校
实用肝脏病杂志 2012年5期
关键词:核苷阿德福拉米夫定

李平 综述 汪茂荣 审校

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染呈世界流行,每年约有100万人死于HBV相关的肝衰竭、肝硬化和肝细胞癌,已成为一个严重的公共卫生问题[1,2]。核苷(酸)类药物(Nucleos/tide analogues)是目前治疗慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)的重要药物,具有抑制病毒迅速、作用效果明显、使用方便和不良反应少等特点,但是大多接受核苷(酸)类药物治疗的患者难以在短期内达到持久应答,而且随着治疗时间的延长,HBV易产生变异耐药,造成抗病毒治疗的失败。随着核苷(酸)类药物种类的增加,可通过联合或替代的方法挽救变异耐药,但是位于逆转录酶(reverse transcriptase,RT)区B亚区第181位氨基酸的变异给抗病毒治疗提出了一个新的“挑战”,因为其变异后不仅仅对阿德福韦产生耐药,而且对拉米夫定、恩替卡韦、替比夫定、替诺福韦的药物敏感性均呈现下降,是一个交叉核苷和核苷酸两类药物的耐药位点[3]。

一、rt181变异的概念

野生型HBV rt181位氨基酸是丙氨酸(Ala,A),编码的碱基为GCT。rt181变异主要有两种模式:当编码密码子第一位碱基的G突变为A后,氨基酸变异为苏氨酸(Thr,T),可写作rtA181T;而当编码第二位碱基的C突变为T后,丙氨酸则变异为缬氨酸(Val,V),可写作rtA181V。由于HBV聚合酶基因和表面抗原基因存在部分重叠区域,RT区的变异也引起S区的改变,rtA181T变异可导致S蛋白第172位色氨酸(Trp,W)变异为终止密码子,写作sW172*;或者置换变异为亮氨酸(Leu,L),写作sW172L。而rtA181V变异则导致S蛋白第173位氨基酸由亮氨酸(Leu,L)变异为苯丙氨酸(Phe,F),写作 sL173F。

二、rt181变异的产生

台湾学者Yeh等[4]最早报道了rt181变异,其对23例拉米夫定治疗耐药的患者进行分析,其中有3位患者体内HBV没有出现常见的YMDD(M552I/V)变异,而是出现了A529T(rtA181T)变异,他们进一步用定点突变的方法在体外证明了rtA181T变异株对拉米夫定耐药。2004年Chien[5]等也报道在接受拉米夫治疗的CHB患者中,有1例患者出现了A529T(rtA181T)变异,并且在停药1年后还能检测到该变异的存在。2006年,法国学者Gerolami等[6]报道在2例接受拉米夫定治疗的患者中,出现rt181的另一种变异模式,即rtA181V变异。

一项关于阿德福韦的多中心随机双盲对照研究发现[7],185例患者经过144周的治疗后,除了3例出现rtN236T变异外,另有3例患者出现rtA181V耐药变异。Yeon等[8]给67例拉米夫定耐药的患者换用阿德福韦治疗,治疗7周后,有2例患者在出现rtA181T变异;治疗12周后,有5例患者出现rtA181V变异。在替比夫定治疗的患者中,也同样发现rt181位点的变异的存在。替比夫定Ⅲ期全球注册的临床研究结果提示[9],在治疗52周HBV DNA阳性的115名患者中,有16人出现rt181位点的变异。而在恩替卡韦初始治疗的患者中,国内302医院赵攀等[10]对5例HBV rtA181T/V变异患者的临床资料进行回顾性调查和随访后认为:rtA181T/V变异的产生与恩替卡韦治疗无关,其变异为自然产生。Warner等[11]对SeqHepB数据库中患者资料进行分析后发现,在未接受任何抗病毒治疗的患者中可检测到rtA181T变异的存在。

三、变异的临床特点

(一)变异发生率 rt181变异的发生率在不同研究中的比例略有区别。澳大利亚的SeqHepB数据库中统计资料显示[11]:在拉米夫定治疗变异的患者中,rtA181T比例为2%;在阿德福韦治疗变异的患者中,rtA181T比例为18%,rtA181V的比例达到50%。而在未接受抗病毒治疗的患者中,rtA181T出现的概率为0.2%。国内徐东平等[12]对340例CHB患者体内HBV进行耐药分析,其中rtA181T变异检出率3.2%,rtA181V检出率0.3%,rtA181T/V/I检出率0.6%。国内另一篇文献[13]对85例CHB患者的HBV测序后发现,有2例患者发生rtA181T变异,2例rtA181V变异,1例rtA181S变异。

(二)变异的组合 和rt204变异一样,rt181变异既可单独存在,又可与其他变异同时存在,不同变异可存在于同一株病毒株上,也可分别存在于不同的病毒株。对rt181变异患者的HBV的RT区序列进行克隆分析,发现rtA181T/V变异可单独存在,也可与 N236T、M204V/I、N236+N238T、L80V、L80V+M204I等变异同时存在[14,15]。

四、变异的生物学特点

(一)复制特性 HBV DNA变异后对于病毒复制能力的影响是多种多样的,可降低其复制能力,可提高其复制能力,或没有影响。在rt181变异的研究中,大部分学者认为rtA181T变异后,HBV复制能力下降。Yeh等[4]最早发现rtA181T变异的同时,在体外构建突变株,转染细胞后检测复制产物,实验发现,rtA181T变异病毒的复制活性比野生型下降了约88%。Warner等[11]构建rtA181T突变质粒转染到Huh 7细胞后,他们发现细胞内的复制中间体明显减少,而在细胞培养上清中检测不到HBV DNA。Yatsuji等[16]通过构建1.4拷贝的HBV rtA181T突变株转染HepG2细胞后,他们发现HBV DNA水平下降了约20%。关于rtA181V变异对复制的影响,只有李新艳等[17]学者将临床分离的rtA181V变异株转染细胞后,发现HBV DNA水平与野生型相比并未见明显差异。而韩国学者[18]将rtA181T/V变异患者的临床数据进行比较,他们将13例rtA181T/V变异患者与9例rt181未变异者配对后认为,两组患者在HBV DNA水平并没有表现出差异。国内有学者将rtM204位点单独突变与rtM204+rtA181T突变患者两者进行比较,发现引起他们变异所用的核苷酸药物不同,但两者病毒学水平无明显差异[19],而对rtN236T变异患者与rtA181T变异患者进行比较后,发现两组患者的HBV DNA水平也没有显著差异[20]。

(二)表面抗原(HBsAg)表达 rtA181T/sW172*变异后,会导致HbsAg合成出现缺陷且引起分泌障碍。Warner等[11]研究发现,由于该变异提前出现终止密码子,可使HBsAg截短约55个氨基酸,随后他们利用Western证实了HBV变异株的表面蛋白减小了6kD;而Western检测同时发现转染变异病毒的Huh7细胞内HBsAg含量明显下降,细胞外HBsAg检测不到。他们进一步通过免疫组化染色发现,rtA181T/sW172*变异后的HBsAg在细胞浆内大量聚集,不能正常分泌到细胞外。尽管在体外研究中证实HBsAg分泌缺陷,但在临床上,发生rtAl81T变异患者的血清HBsAg滴度与未变异者并无明显差异[18]。其可能的原因是:患者体内的病毒群是混合的,即同时存在非变异毒株,这些毒株所产生的非变异型HBsAg可以装配变异的HBV,并纠正分泌缺陷。Warner等[11]按不同比例转染变异株和未变异株质粒,随着未变异株质粒所占比例的增加,HBV分泌缺陷能够被逐渐挽救。国内研究也发现,当rtAl81非变异株占10%时,即可在细胞培养上清液中检测到HBsAg表达,且随着非变异株所占比例增加,HBsAg表达也逐步增加,表明rtAl81T/sWl72*变异株导致的HBsAg分泌缺陷已被rtl81非变异株纠正[17]。

(三)药物敏感性 药物敏感性通常用半数有效浓度(EC50)或半数抑制浓度(IC50)来评价,其原理是定点突变或从体内分离出变异的病毒株,转染细胞后,再加入不同浓度的核苷(酸)类似物,培养一段时间后检测HBV复制情况,并与野生株病毒的EC50/IC50比较,判断耐药性。目前体外实验结果提示,rtA181T/V变异病毒对大部分核苷(酸)类药物均呈现一定程度的耐药性。Villet等[14]实验结果提示,rtA181T变异病毒对拉米夫定、阿德福韦、替诺福韦的药物敏感性分别下降了5.7~10.8倍,2.1~4.5倍,2~2.9倍;rtA181V变异病毒则分别下降了 1.5~7.7倍,2.4~7.8倍,1.2~3.2倍;而 rtA181T或 rtA181V变异病毒对恩替卡韦的敏感性改变尚不明显。他们研究还发现,当出现rtA181T/V联合rtN236T变异后,耐药性较rtA181T/V单点变异明显上升。而有学者等[21]研究发现,rtA181V变异病毒株对阿德福韦、替诺福韦的敏感性分别降低了4.2倍和3倍;但对拉米夫定、恩替卡韦和恩曲他滨的敏感性降低12~15倍,对其他核苷类似物,包括克来夫定、替比夫定、L-dC、L-dA则呈现完全交叉耐药(敏感性下降>80倍)。

(四)与肿瘤关系 台湾学者Lai等[22]对一位39岁的血清HBeAg阳性,而HBsAg阴性的肝癌患者进行研究,发现其HBsAg阴转是由于体内HBV出现了rtA181T/sW172*变异。他们进行体外研究发现rtA181T/sW172*变异能够转录激活猿猴空泡病毒40(SV 40)和癌基因c-Myc,从而促使肿瘤的发生。而他们利用裸鼠进行的动物实验结果提示,rtA181T/sW172*变异的细胞可在裸鼠体内促使肿瘤的形成。国内[23]也报道:rtA181T/sW172*变异后,HBsAg的分泌缺陷导致蛋白在内质网中堆积,可激活内质网信号通路grp78基因,从而诱使肝癌的发生。

五、rt181变异的对策

目前尚无临床试验对HBV rt181耐药患者的治疗方法进行评价,仅有一些临床治疗的经验报道。有研究[21]报道,接受阿德福韦治疗产生rtAl81V变异的患者,改用或加用拉米夫定能使HBV DNA降低2-3个logl0 copies/ml,但并不能完全抑制HBV复制。他们认为rtAl81V变异病毒对替诺福韦敏感性改变最少。但是Patterson等[24]通过96周的随访发现,TDF治疗rtA181T/V变异患者的抑制病毒能力明显下降,尤其是rtA181V合并rtN236T同时变异时,突变株能使TDF抗病毒活性下降10倍以上。Kurashige等[25]报道1位e抗原阳性,HBV DNA大于7.6 log10copies/ml的患者,在接受拉米夫定治疗后,出现rtA181T变异,当换用恩替卡韦后,病毒量起初略有下降,随后即出现反弹,而此时耐药转为rtM204V+L180M+S202G变异,当联用拉米夫定和阿德福韦后,rtA181T变异再次成为主要变异;最后联用恩替卡韦和阿德福韦后,病毒降到了3.7 log10 copies/ml。他们认为恩替卡韦和阿德福韦联用,能最大程度控制rtA181T和rtM204V的相关耐药。而一些个案报道[26]认为,rtA181T/V变异的患者,换用恩替卡韦治疗后,能够有效抑制病毒复制。目前EASL建议[27]这些发生rtA181T/V变异的患者,给予其加用恩替卡韦,或者使用替诺福韦联合恩曲他滨,但是在临床上能否有效抑制反弹的变异病毒,目前还有待进一步的观察和随访。

六、结语

核苷(酸)类药物通过与HBV DNA聚合酶的自然底物dNTP竞争,而抑制HBV复制。在药物或免疫的长期压力下,在HBV复制过程中(尤其在逆转录过程中),由于聚合酶缺乏严格校正机制,HBV聚合酶区会出现较高频率的变异,相应氨基酸序列改变后影响到空间结构,导致核苷(酸)类药物与聚合酶结合能力明显降低,便发生了耐药现象。当前除恩替卡韦以外的核苷(酸)药物几乎均可导致rt181变异的产生。虽然其变异后病毒缺陷,病毒量不会大幅度的反弹,HBsAg、ALT的水平也没有明显改变[28]。但由于其交叉核苷和核苷酸耐药,对即将在国内上市的替诺福韦亦不敏感,因此给临床长远的治疗用药带来困难。

在临床工作中,我们在努力寻找耐药变异对策的同时,更应做好耐药的预防工作。对于需要长期抗病毒治疗的患者来说,可选用抑制HBV能力强、耐药发生率低的药物;或选择核苷与核苷酸类药物联合用药,以减少或延缓耐药性的发生。

[1]Ganem D,PrinceAM.HepatitisB virusinfection-natural history and clinical consequences.N Engl J Med,2004,350(11):1118-1129.

[2]中华医学会肝病学分会和感染病学分会.慢性乙型肝炎防治指南(2010年版).实用肝脏病杂志,2011,14(2):81-89.

[3]Zoulin F,Locarnini S.Hepatitis B virus resistance to nucleos(t)ide analogues.Gastroenterology,2009,137(5):1593-608.

[4]Yeh CT,Chien RN,Chu CM,et al.Clearance of the original hepatitis B virus YMDD-motif mutants with emergenceof distinct lamivudine-resistant mutants during prolonged lamivudine therapy.Hepatology,2000,31(6):1318-1326.

[5]ChienRN.YehCT,WangPN,etal.Acuteleukaemiain chronic hepatitis B patients with lamivudine therapy.Int J Clin Pract,2004,58(11):1088-1091.

[6]Gerolami R,Bourliere M,Colson P,et al.Unusual selection of rtA181V HBV mutants crossresistantto adefovir following prolonged lamivudine monotherapy:report of two cases.Antivir Ther,2006,11(8):1103-1106.

[7]Hadziyannis SJ,Tassopoulos NC,Heathcote EJ,et al.Long-term therapy with adefovir dipivoxil for HBeAg-negative chronic hepatitis B.N Engl J Med,2005,352(26):2673-2681.

[8]Yeon JE,Yoo W,Hong SP,etal.Resistance to adefovir dipivoxil in lamivudine resistant chronic hepatitis B patients treated with adefovir dipivoxil.Gut,2006,55(10):1488-1495.

[9]Lai CL,Gane E,Liaw YF,et al.Telbivudine versus lamivudine in patients with chronic hepatitis B.N Engl J Med,2007,357(25):2576-2588.

[10]赵攀,钟彦伟,徐东平.5例应用恩替卡韦治疗的慢性HBV感染者发生HBV逆转录酶区单独A181位点突变的分析.临床肝胆病杂志,2011,27(3):289-291.

[11]Warner N,Locarnini S.The Antiviraldrug selected hepatitis B virus rtA181T/sW172* mutant has a dominant negative secretion defect and alters the typical profile of viral rebound.Hepatology,2008,48(1):88-98.

[12]徐东平,刘妍,成军,等.340例慢性乙型肝炎患者乙型肝炎病毒多位点耐药相关突变分析.中华肝脏病杂志,2008,16(10):735-738.

[13]吴云海,吴云萍,张晓棠,等.HBV反转录酶A181位点变异与临床耐药的关系. 肝脏,2009,14(2):105-107.

[14]Villet S,Pichoud C,Billioud G,et al.Impact of hepatitis B virus rtA181V/T mutants on hepatitis B treatment failure.J Hepatol,2008,48(5):747-755.

[15]吴珍萍,韩涛,高英堂,等.拉米夫定耐药后阿德福韦酯治疗应答欠佳患者乙型肝炎病毒耐药变异模式.中华肝脏病杂志,2010,18(5):498-501.

[16]Yatsuji H,Noguchi C,Hiraga N,et al.Emergence of a novel lamivudine-resistant hepatitis B virus variant with a substitution outside the YMDD motif.Antimicrob Agents Chemother,2006,50(11):3867-3874.

[17]李新艳,尹有宽,张继明,等.阿德福韦耐药乙型肝炎病毒毒株生物学特性的研究.中华传染病杂志,2009,27(8):478-483.

[18]Kim JH,Jung YK,Joo MK,et al.Hepatitis B viral surface mutations in patients with adefovir resistant chronic hepatitis B with A181T/V polymerase mutations.JKorean Med Sci,2010,25(2):257-264.

[19]王春亚,钟彦伟,刘杰,等.HBV逆转录酶区M204位点单独突变患者与M204+A181T联合突变患者临床特征的比较.实用肝脏病杂志,2010,13(4):260-262.

[20]王春亚,钟彦伟,杨昊臻,等.HBV逆转录酶区N236T突变与A181T突变患者的临床特征的比较.实用医院临床杂志,2010,7(4):47-48.

[21]Qi X,Zhu Y,Curtis M,et al.In vitro cross-resistance analysis of the HBV polymerase mutation A181V.J Hepatol,2005,42(Suppl 2):194-195.

[22]Lai MW,Yeh CT.The oncogenic potential of hepatitis B virus rtA181T/surface truncation mutant.Antivir Ther,2008,13:875-879.

[23]郑佳佳,蒋素贞,张婷,等.HBV sW172*耐药突变体引起的截短蛋白胞内堆积可能通过ER stress通路参与致肝癌机制.南京:第15届全国病毒性肝炎及肝病学术会议,中华医学会,2011,100-101.

[24]Patterson SJ,George J,Strasser SI,et al.Tenofovir disoproxil fumarate rescue therapy following failure of both lamivudine and adefovir dipivoxil in chronic hepatitis B.Gut,2011,60(2):247-254.

[25]KurashigeN,OhkawaK,Hiramatsu N,etal.Twotypesof drug-resistant hepatitis B viral strains emerging alternately and their susceptibility to combination therapy with entecavir and adefovir.Antivir Ther,2009,14(6):873-877.

[26]Choe WH,Hong SP,Kim BK,et al.Evolution of hepatitis B virus mutation during entecavir rescue therapy in patients with antiviral resistance to lamivudine and adefovir.Antivir Ther,2009,14(7):985-993.

[27]European Association For The Study Of The Liver.EASL clinical practice guidelines:Management of chronic hepatitis B.J Hepatol,2009,50(2):227-242.

[28]王春亚,钟彦伟,刘杰,等.HBV逆转录酶区A181T突变的临床意义. 军医进修学院学报,2010,31(11):1125-1126.

猜你喜欢
核苷阿德福拉米夫定
多替拉韦联合拉米夫定简化方案治疗初治HIV感染者真实世界研究
恩替卡韦在阿德福韦单药治疗患者中的应用
恩替卡韦在阿德福韦酯单药治疗患者中的应用
RP-HPLC法同时测定猴头菌片中5种核苷
HPLC法同时测定新疆贝母中3种核苷类成分
拉米夫定联合阿德福韦酯治疗慢性乙型肝炎的效果观察
恩替卡韦与拉米夫定初次治疗慢性乙肝的效果和安全性比较
蛹虫草中4种核苷的含量分析
长期治疗,受益终生:浅谈核苷(酸)类药物的长期治疗
阿德福韦酯联用五酯滴丸治疗慢性乙型肝炎31例