真皮IL-17分泌型γδT细胞在炎症性皮肤病中起关键作用

刘钧天 摘译 郑捷 校

表达白细胞介素-23（IL-23）和白细胞介素-17A（IL-17A）的辅助性细胞（Th17细胞）轴在慢性炎症性疾病的银屑病发生发展中起着重要作用。但IL-17等是否来源于Th17细胞尚不明确，其是否在银屑病的炎症浸润和棘层肥厚皮损形成中起作用是本文研究的重点。

小鼠表皮中有大量树突样表皮T细胞（γδT细胞），同样人类真皮中也存在γδT细胞。我们发现，IL-23刺激后，真皮中固有的γδT细胞大量产生IL-17。而表皮γδT细胞和真皮αβT细胞产生IL-17较少。研究表明IL-17分泌型γδT细胞在银屑病患者的皮损中有大量浸润。主要研究结果如下。

1 IL-23是皮肤中促进IL-17分泌的关键细胞因子

应用免疫荧光染色分析健康志愿者和银屑病患者皮肤组织，确定IL-23的细胞来源。发现真皮的树突状细胞(DC)和巨噬细胞(Mφ)在银屑病皮损中明显增多。在咪喹莫特（IMQ）加重银屑病鼠模型中，IL-23和IL-17的mRNAs转录明显升高。说明DC和Mφ是分泌IL-23的主要细胞。

2 真皮γδT细胞是在IL-23刺激后分泌IL-17的主要细胞

分别制备小鼠真皮和表皮细胞单细胞悬液以检测IL-17的细胞来源。表皮中的T细胞几乎均为CD3和TCRγδ高表达的γδT细胞，在IL-23刺激下不产生任何IL-17；相反，真皮中的γδT细胞在IL-23刺激后分泌IL-17。又将皮肤中的CD3+TCRγδ+细胞分离出来，给予单纯IL-23、IL-1β或联合刺激。结果发现，单独给予IL-23或者IL-1β均不能刺激真皮γδT细胞产生IL-17，只有IL-23和IL-1β联合刺激才可产生大量IL-17。使用IL-1β单抗处理或IL-1受体敲除鼠（IL-1R-/-）的皮肤细胞，进一步证实了在IL-23诱导的真皮γδT细胞分泌IL-17中需要IL-1β的协同参与。

3 真皮IL-17分泌型γδT细胞具有特定的表型和取用格式

为了解真皮γδT细胞是否具有特定的TCR取用片段，使用包括 Vγ1、Vγ4、Vγ5、Vγ6 和 Vγ7 等VγTCR特异性抗体检测其取用格式。小部分真皮γδT细胞主要表达Vγ4，绝大部分表皮γδT细胞专一性表达Vγ5并有一部分与Vγ6抗体有交叉反应。约50% IL-17分泌型真皮γδT细胞表达Vγ4。给鼠注射Vγ4单抗，γδT细胞分泌IL-17的能力明显降低。

趋化因子受体CCR6和转录因子RORγt与CD4+Th17细胞的分化及趋化作用有关。发现真皮γδT细胞组成性的表达CCR6和RORγt，而表皮γδT细胞却没有表达。

CD27被认为是区分干扰素γ（IFN-γ）分泌型γδT细胞及IL-17分泌型γδT细胞的关键细胞因子。表皮及真皮γδT细胞均是CD27-且不分泌IFN-γ。

4 IL-23和IMQ诱导的皮肤炎症及棘层肥厚需要γδT细胞的参与

野生型鼠（WT鼠）皮内注射IL-23可导致表皮增厚和大量中性粒细胞浸润，在基因敲除TCRα-/-鼠表皮内亦有大量浸润，但在基因敲除TCRδ-/-鼠中浸润明显较轻。说明IL-23诱导的皮肤炎症反应和棘层肥厚需要γδT细胞参与。

IMQ刺激皮肤后，真皮γδT细胞自发分泌大量IL-17。分别给 WT 鼠、TCR α-/-鼠和 TCRδ-/-鼠涂抹IMQ乳膏。其中WT鼠和TCR α-/-鼠在IMQ处理后出现表皮增厚和大量中性粒细胞浸润，而TCRδ-/-鼠却浸润轻微。

5 IL-17受体在IL-23诱导的表皮增厚和皮肤炎症中起重要作用

IL-17细胞因子家族包括6个成员，它们分别是IL-17A～F，通过IL-17受体（IL-17R）复合物参与炎症反应。IL-17R在造血组织和银屑病皮损中广泛表达。与WT鼠模型相比，IL-23诱发IL-17RA-/-鼠的表皮增殖和中性粒细胞浸润程度明显减轻。Realtime PCR显示WT鼠和IL-17RA-/-鼠在IL-23刺激后IL-17和IL-22 mRNA水平均明显增高，TNF-α、MMP-9和 IFN-γ mRNAs没 有 明 显 改 变， 而 IL-6 mRNA水平在IL-17RA-/-小鼠中明显降低。说明下游的IL-17R信号通路在IL-23诱导的表皮增厚等皮肤表现上起作用。

6 IL-23可以在体外刺激真皮γδT细胞的增生

单独给予TLR2配体Pam3CSK和其他病原体并没有刺激真皮γδT细胞增生，而IL-23单独刺激却显著促进真皮γδT细胞增生。

通过胞内染色发现TLR2配体Pam3CSK、TLR7配体Gardiquimod和TLR9配体CpG刺激真皮γδT细胞产生低水平的IL-17，而脂多糖（TLR4）和dectin-1的配体curdlan对真皮γδT细胞分泌IL-17无明显作用。病原体产物联合IL-23刺激皮肤细胞IL-17的平均荧光强度（MFI）明显增强；ELISA同样发现病原体产物和IL-23对IL-17分泌的协同效应。

7 在银屑病患者皮损中有大量IL-17分泌型γδT细胞

在银屑病皮损中CD3+T细胞明显增多，真皮γδT细胞的比例和健康志愿者相比明显增高。通过共聚焦显微技术发现患者皮损真皮中有γδT细胞浸润。健康对照组真皮γδT细胞即使给予IL-23刺激也只能产生极少的IL-17；而银屑病皮损中有15% γδT细胞产生IL-17。

讨 论

结果显示，鼠模型中真皮γδT细胞是IL-17的主要来源。IL-23R可刺激产生皮肤炎症和棘层肥厚。但在TCRδ-/-鼠和IL-17RA-/-鼠中，IL-23诱导和IMQ诱导的皮肤炎症明显较轻。

在银屑病患者皮损和IMQ诱导的银屑病鼠模型中均发现IL-23可以促进真皮γδT细胞分泌IL-17，同时，需要内源性的IL-1β参与。

真皮γδT细胞的独特之处在于：真皮γδT细胞均为CCR6+细胞，不表达CD27，不分泌IFN-γ，说明真皮γδT细胞是“专职”IL-17分泌细胞； IL-23可在体外刺激真皮γδT细胞增生，然而对脾脏γδT细胞的增生无影响。γδT细胞在银屑病发病中的重要作用，敲除了该基因的鼠银屑病模型皮肤炎症反应明显减轻。

与IL-23诱导的银屑病鼠模型不同，IMQ诱导的银屑病在TCR α-/-鼠中其表皮增厚也明显减轻，显示αβT和γδT细胞在IMQ诱导的皮肤炎症反应中均有作用，但是IMQ诱导的中性粒细胞浸润程度在TCRδ-/-鼠中明显降低，而在TCR α-/-鼠没有变化。此外，WT、TCR α-/-和 TCRδ-/-3种小鼠在 IMQ 刺激后其 IL-22的mRNA水平没有明显区别。以上这些结果说明IL-17、IL-22、γδT细胞和αβT细胞在IL-23或IMQ诱导的皮肤炎症改变中对皮肤的组织病理改变不同。

本研究还发现了病原体对γδT细胞产生IL-17有刺激作用，支持了感染在银屑病发病中起作用。TLR和dectin-1的配体在联合IL-23刺激时促进了真皮γδT细胞分泌IL-17，这种协同作用同时需要IL-1R信号通路的参与。CD44hiCCR6+γδT细胞表达TLR1、TLR2和dectin-1，因此病原体产物可能直接刺激真皮γδT细胞分泌IL-17。

总之，银屑病皮损真皮中γδT细胞的大量增生说明它们在慢性炎症反应中也发挥决定作用。