正交试验法优选银杏叶提取条件※

宋伟峰马斌李瑞明

正交试验法优选银杏叶提取条件※

宋伟峰1马斌2李瑞明2

目的采用正交试验法优选银杏叶破碎提取的最佳条件。方法考察溶剂用量、乙醇浓度和提取时间3个因素，每个因素选取3个水平进行实验。结果与结论最佳工艺为A3B3C3，即用10倍量70%乙醇破碎提取2次，时间为3min，优选得到的工艺稳定可行。

银杏叶；正交试验；破碎提取

银杏叶又名白果叶、公孙树叶等，为最古老的中生代孑遗植物银杏Ginkgo biloba L的干燥叶。由于发现其所含的主要成分黄酮苷（Ginkgo flavone glycosides）能有效地清除体内有毒过氧自由基的作用、银杏内酯（Ginkgolides）具有高度的专属性抗血小板活化因子（PFA）的作用[1]而引起医药界的关注，德国Schwabe公司开发的银杏叶制剂Tebonin已成为名牌畅销药[2]。破碎提取为袁珂等在分析各种传统溶剂提取法优缺点的基础上，提出并建立了一种新的提取方法。本文采用正交试验对银杏叶的破碎提取进行了研究，优选出最佳工艺条件。

1 仪器及试剂

1.1仪器自动真空旋转蒸发仪（带CA-111A冷却水循环装置）（日本EYELA NE-SERIES），SHZ-95多用循环水式真空泵(郑州市巩县英峪予华仪器厂)，超级恒温水浴（上海市实验仪器厂），日立牌VA-W15Y型破碎混合器，托盘式扭力天平（上海第二天平仪器厂生产），101-1型恒温鼓风烘箱（上海市实验仪器厂），美国Waters公司2695型高效液相色谱仪。

1.2试剂槲皮素对照品（供含量测定用，批号10081-201006），山奈素对照品（供含量测定用，批号110861-201003），异鼠李素对照品（供含量测定用，批号110860-201005），以上对照品均有中国药品生物制品检验所提供。甲醇为色谱纯，水为重蒸馏水，其它试剂均为分析纯。药用酒精；银杏叶购买自邳州银杏叶制品有限公司。

2 方法与结果

2.1银杏总黄酮苷含量测定的方法银杏总黄酮苷含量测定的色谱条件与系统适用性实验、对照品溶液的制备、银杏叶供试品溶液的制备、测定方法均按照中国药典银杏叶项下黄酮苷的含量项目规定进行[4]。实验中提取液中总黄酮的测定为，移取适当体积的样品加入圆底烧瓶中，加入甲醇-25%盐酸溶液（4:1）混合溶液 25mL，置水浴上加热回流60min，迅速冷却至室温，转移至50mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45m）滤过，取续滤液，即得。

2.2正交设计选取银杏叶总黄酮提取率为考察指标，选用(34)正交方案，考查了溶剂用量、提取次数和提取时间3个因素，每个因素3个水平设计试验方案，以确定破碎提取法的最佳提取条件，见表1。

表1 正交实验水平

2.3正交表的选用及结果按因素水平表所列的各因素水平，选用(34)正交方案进行试验。操作方法：每次取银杏叶 20g，按正交表所列顺序进行破碎提取，合并提取液，测定总体积和总黄酮的含量，计算出提取率。具体设计及结果见表2。对表2进行方差分析，结果见表3。

表2 正交实验结果

表3 方差分析结果

由表2直观分析数据显示，各因素的影响大小顺序为B乙醇浓度＞A溶剂用量＞C提取时间。由同一因素的三个水平比较得知：A3＞A2＞Al、B3＞B1＞B2、C3＞C1＞C2、最佳工艺条件为A3B3C3。方差分析表明，因素B提取乙醇浓度和因素A溶剂用量对指标成分转移率有显著性差异F比＞F临界值，C提取时间比不具有明显的显著性。正交给出的最佳工艺条件为A3B3C3，即加10倍量的70%乙醇，提取2次，每次3min。按最佳方案进行对比验证实验。

2.4验证实验称量粉碎好的银杏叶20g，共3份，分别按照最佳条件进行实验，收集乙醇溶液，测定体积及银杏总黄酮含量，计算总黄酮的提取率。结果3次实验的提取率为96.03%，RSD为6.7%。该方法转移率高，工艺稳定，可作为破碎提取银杏总黄酮的最佳工艺。

3 讨论

银杏叶黄酮苷类成分对热和光都比较敏感，在强光照射及长时间加热的情况下都容易氧化失去活性。因此，本实验设计提取次数为2次，每次为3min。即可提高提取的效率又可降低了长时间，高浓度下氧化破坏，提高了水溶性黄酮苷的提取效果率。破碎提取的主要原理是在适当溶剂存在下，利用高速旋转的特殊刀具将药材充分剪断至微米程度，使细胞组织中的成分快速转移至溶剂中，通过过滤即可。因此，不但可以避免加热，而且提取效率大为提高，一次提取l～2min即可完成，为进行中草药中不耐热成分的提取及提高提取效率展示了新的途径[5]。

[1]Braquet P.Drugs Fut1987,12(7):63.

[2]钟雪庐,乐嘉赓.我国开发银杏叶制剂现状与前景[J].中国药房,1994,5(5).

[3]袁珂,村延释,翼眷茹.中草药化学成分研究中几种不同提取方法的比较研究[J].天然产物研究与开发,1997,9(4):57.

[4]中华人民共和国药典委员会.中国药典,I部[S].北京:化学工业出版社,2010.

[5]刘延泽,袁珂,冀春茹.中草药化学成分提取的新方法:—植物组织破碎提取法(EMS)[J].河南科学,1993,11(4):265-268.

Optimum Extraction of Ginkgo biloba by Orthogonal Test

Song Weifeng Ma Yanbin Li Ruiming

ObjectiveTo study the new extract process of Ginkgo biloba.MethodsUsing the orthogonal design,we observed the effect of solvent,solvent dosage,and extractive time on the content of total flavonoid.Results and conclusionThe best extraction condition was A3 B3 C3,that is,the amount of 70%ethyl alcohol added to 10 times,smashed for 2 times,and extracted 3mins.The extraction process was stable and usable.

Ginkgo biloba; Smashing extraction method; Orthogonal Design

1中山大学附属第三医院药学部，广东广州 510630

2中山大学附属第一医院药学部，广东广州 510080

广东省重大科技专项项目（2011A080300004）

宋伟峰（1972.4-），男，本科，主管药师，研究方向：医院药学，Tel:020-85252500,E-mail:swflsy@163.com.

李瑞明（1974，07-），男，本科，主管药师。E-mail:liruiming321@163.com.