超高压液相色谱－串联质谱测定水产养殖环境中的痕量氯霉素

张星炜，房宝玲，李君华

（1.邯郸市环境保护局，河北 邯郸 056000；2.邯郸学院，河北 邯郸 056000；3.河北省科学院生物研究所，河北 石家庄 050081）

氯霉素（Chloramphenicol，CAP）是一种有效的广谱抗菌素，常常用于水产养殖中鱼虾等疾病的预防和治疗。氯霉素大量使用导致水产养殖环境污染和生态毒害问题日益严重［1］。虽然氯霉素的半衰期短，但氯霉素的频繁使用并持续进入水环境，形成了“假持续”现象，通过生物链的富集，能够引起动物和人机体产生抗药性和微生物菌群的失衡，甚至会引起过敏性变态反应、血液疾病、再生障碍性贫血、白血病等疾病，严重威胁生态环境的协调发展和人类的健康生活。因此，氯霉素的残留污染已经成为国际上广泛关注的热点话题之一。

目前对于氯霉素研究的热点集中于动物性食品中氯霉素的残留检测，对于环境中特别水产养殖环境中的氯霉素污染则研究不多，加之环境介质中的氯霉素污染物含量极低（多在10－9～10－12级），分析难度大、研究成本高，这也是环境中抗生素污染研究难以广泛和深入开展的重要原因［2－4］。本文通过对水产养殖环境中的氯霉素污染物进行固相萃取，用液质联用（Lc－Ms）进行检测，初步建立了水产养殖环境中氯霉素含量的分析方法。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

氯霉素标准品 （纯度大于99%，购于SIGMA公司）；甲醇、乙腈、丙酮、正丙醇、正己烷、乙酸钠、乙酸铵等均为色谱纯（Siigma），购自天津化学试剂一厂。

1.2 仪器设备

Agilent 1100高效液相色谱仪和 ABI／SCIEX API4000液质联用仪；Qasis HLB柱（waters，6mL／500mg）；快速混匀器（QL－901江苏麒麟医用仪器厂）；砂芯漏斗、真空泵（天津津腾实验设备有限公司）；过滤膜（0.45μm）购自天津东康科技有限公司；N－EVAPTM型氮吹仪，美国Organomation公司。

1.3 标准品配置

氯霉素标准品配置：用甲醇配置1000μg／mL的氯霉素储备液，用时稀释到所需的浓度。

1.4 方法

1.4.1 色谱条件［5－6］

色谱柱：Waters Acquity BEH C18（50mm×2.1mm，1.7μm）；进样量：20μL；柱温：40℃；流速：0.4mL／min；流动相：乙腈（A）和0.5%甲酸溶液（B）；梯度淋洗程序，25%A保持3min，然后在2min内将A线性增加至80%并保持8min，最后在2min内由80%线性回落到起始的25%并保持5min。

1.4.2 质谱条件［7－8］

离子源：电喷雾离子源（ESI）；检测方式为多反应监测（MRM）离子模式，正离子检测；离子源Ⅰ（GS1）和Ⅱ（GS2）的气体流速分别为20和40mL／min，碰撞气和气帘气流速分别为0.18和0.2mL／min，气体均为高纯氮气N2；辅助加热气温度，450℃；电离电压，5500V。

1.4.3 样品前处理

取500mL水样，通过0.45μm滤膜过滤，去除悬浮物。滤液用HLB固相萃取柱［9］进行富集（HLB柱使用前先后用6mL甲醇、6mLpH为3.0的5mmol／L乙酸铵缓冲液进行预处理），滤液以3～5mL／min流速通过小柱，萃取富集后，柱于氮气保护下干燥1h，最后用6mL甲醇洗脱HLB固相萃取柱，收集洗脱液并浓缩至近干，用V（甲醇）∶V（水）＝60∶40溶液定容至1mL，待测。

1.4.4 定量方法

峰面积外标法定量，公式如下：

式中X：试样中氯霉素残留量，单位为μg／kg；

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C：标准工作溶液的浓度，单位为ng／ml；

A：试样中所含氯霉素的色谱峰面积；

V：试样终定容体积，单位mL；

As：标准工作液的峰面积；

W：试样溶液所代表样品的质量，单位g。

2 结果和分析

2.1 氯霉素的质谱特征

将氯霉素标准溶液进行全扫描，找出准确的［M＋H］＋的分子离子峰，然后对其进行轰击，找出信号较强的碎片离子，以母离子与子离子组成监测离子对，以多反应检测（MRM）模式进行检测，优化色谱和质谱条件。优化后的参数见表1。

表1 氯霉素的串联质谱检测参数

2.2 线性关系及测定范围

经过优化色谱和质谱的条件后，测定的氯霉素的色谱图，见图1。结果显示，氯霉素在0.5～30ng／L的范围内具有良好的线性（r＝0.999），回归方程为y＝75.3x－74。

图1 测定养殖渔塘水中的痕量氯霉素离子流色谱图

2.3 检出限

以相当于3倍噪音的响应值计算检出限，该仪器的检出限为0.01ng／L。如果海水量以1000mL计，该分析方法最低可以测定海水样品中0.2ng／L的氯霉素。

2.4 样品的加标回收率和精密度

以空白的养殖鱼塘水为基底，加标质量为0.1、1.0、5.0ng／L，按1.4的方法进行前处理和色谱分析，每个质量浓度水平平行测定5份，考察方法的总体回收率和相对标准偏差。分析结果详见表2。在表2中可以看出：在各加标水平上，养殖渔塘水中的氯霉素的平均回收率在81.0%～105.5%，相对标准偏差（RSD）在1.4%～9.5%之间。由此可知，本研究中所建立的方法，回收率和相对标准偏差均能满足样品分析要求。

表2 养殖渔塘水中氯霉素的加标回收率和精密度

2.5 实际样品测定

对大小4个养殖渔塘进行取样测定，采用建立的方法应用于目标氯霉素的分析，以反映在养殖鱼塘环境中的氯霉素污染情况。

样品测定结果表明，4个养殖渔塘均检测出氯霉素，质量浓度在0.9～10.0ng／L之间。部分养殖渔塘存在不同程度的氯霉素痕量污染。

3 讨论

本研究对HLB固相萃取－液质联用方法进行了优化，检测灵敏度大大提高，线性范围在0.5～30ng／L之间，检测结果准确可靠。应用此方法测定4个鱼塘的养殖渔塘环境中的痕量氯霉素，结果均检测出了不同程度的氯霉素污染。

［1］ 周启星，罗义，王美娥.抗生素的环境残留、生态毒性及抗性基因污染［J］.生态毒理学报，2007，2（3）：243～250.

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［6］ 刘玉春，徐维海，余莉莉等.固相萃取液相色谱－质谱／质谱联用测定河水中大环内酯类抗生素［J］.分析测试学报，2006，25（2）：1～5.

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