多种抑癌基因在食管鳞状细胞癌中的甲基化状态及其临床意义*

王长春 毛伟敏 凌志强

浙江省肿瘤医院 浙江省肿瘤研究所肿瘤分子遗传实验室

浙江省胸部肿瘤（肺、食管、乳腺）诊治技术研究重点实验室（310022）

肿瘤的表观遗传学研究已成为近年肿瘤研究的热点问题。有研究发现多种肿瘤包括胃癌、食管癌中可见基因启动子区5’CpG岛异常甲基化[1,2]，食管癌前病变Barrett食管中抑癌基因APC基因启动子区亦存在高甲基化[3]。大量研究已证实抑癌基因甲基化与食管癌相关，但多种抑癌基因启动子区5’CpG岛甲基化与肿瘤家族史的研究鲜见报道。本研究通过检测食管鳞状细胞癌（ESCC）患者中多种抑癌基因的甲基化状态，旨在探讨其与肿瘤家族史和预后的相关性，为进一步研究肿瘤易感家族提供依据。

对象与方法

一、研究对象

选取2010年2～7月浙江省肿瘤医院76例经病理检查确诊的ESCC患者，均为首诊病例，术前未接受过放、化疗以及其他任何治疗。其中男61例，女15例，年龄40～76岁，中位年龄60岁。食管上/中段病变46例，下段30例；高/中分化60例，低分化16例。有肿瘤家族史（定义为两代以内有直系亲属曾患有恶性肿瘤）者16例，其中食管癌5例，结肠癌2例，胰腺癌2例，肺癌2例，淋巴瘤2例，白血病、胃癌和肾癌各1例；无肿瘤家族史者60例。按照国际抗癌联盟（UICC）和美国肿瘤联合会（AJCC）2009第7版TNM分期标准，Ⅰ期5例，Ⅱ期30例，Ⅲ期40例，Ⅳ期1例。本研究方案经浙江省肿瘤医院伦理委员会批准同意，患者均签署知情同意书。

二、方法

1.组织DNA提取：手术切除标本后，由专人负责取组织标本。肿瘤组织标本取自癌巢，癌旁正常组织取自距肿瘤边缘5 cm处，切取后立即置于液氮-76℃保存。采用苯酚/氯仿法提取基因组DNA（杭州化学试剂有限公司），置于－20℃保存待测。

2.DNA亚硫酸氢盐修饰：以紫外分光光度计（型号NanoDrop ND-1000）测定DNA浓度和纯度，A260nm/A280nm比值≥1.8的DNA判定为合格样本。基因组DNA行亚硫酸氢盐修饰和纯化，具体步骤按EpiTect Bisulfite Kits（Qiagen）说明书操作。

3.MSP 检测：参照 APC、RARβ2、CDH1、p16INK4a和RASSF1A基因序列，分别设计5’CpG岛特异性甲基化和非甲基化引物，所有引物由Invitrogen公司合成（见表1）。PCR反应体系20μl，反应条件：95℃预变性 10 min；95℃变性 15 s，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，共40个循环；72℃延伸10 min[2]。采用2-△CT法定量分析各抑癌基因的甲基化状态。以体外经SssⅠ甲基转移酶处理过的人类基因组DNA作为阳性对照。

三、统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件。计数资料的比较采用χ2检验；生存分析采用Kaplan-Meier分析，终点事件为肿瘤复发或死亡，观察无进展生存期（progression-free survival,PFS）。P<0.05 为差异有统计学意义。

结 果

一、基因启动子区甲基化状态

ESCC患者肿瘤组织APC、RARβ2、CDH1、p16INK4a、RASSF1A的甲基化率分别为44.7%、72.4%、72.4%、86.8%、55.3%，均显著高于相应癌旁正常组织，差异均有统计学意义（P=0.000）（见表 2）。

表2 ESCC患者肿瘤组织和癌旁正常组织中各抑癌基因甲基化率的比较 n（%）

二、甲基化与肿瘤家族史

16例有肿瘤家族史的ESCC患者中，肿瘤组织 APC、RARβ2、CDH1、p16INK4a、RASSF1A的甲基化率分别为75.0% （12/16）、100% （16/16）、93.8%（15/16）、93.8%（15/16）、100%（16/16）；60 例无肿瘤家族史者中，甲基化率分别为36.7%（22/60）、65.0%（39/60）、66.7%（40/60）、85.0%（51/60）和 43.3%（26/60），两组相比差异均有统计学意义（P<0.05）。

表1 各抑癌基因甲基化特异性PCR反应引物和片段长度

三、生存分析

66例ESCC患者有随访结果，其中18例复发或死亡，另有10例失访。经Kaplan-Meier分析，CDH1和RASSF1A非甲基化患者的平均生存期均明显高于甲基化患者（P=0.015、P=0.016），其余 3种抑癌基因甲基化与否对预后的影响无明显差异（见表 3、图 1）。

讨 论

肿瘤的病因和发病机制复杂，其中抑癌基因起重要调控作用。APC基因涉及调节细胞黏附、细胞迁移乃至细胞凋亡，其调控方式是与微管结合，调节胞液中β-catenin蛋白水平；RARβ2是一种抑癌基因，定位于染色体3p24，通过在靶细胞中转化成视黄酸而发挥作用，其启动子区甲基化可引起癌症的发生[4]；p16基因主要通过调节细胞周期来参与肿瘤的发生，其调节机制可能通过Rb基因依赖途径实现[5]；CDH1基因参与同型细胞间黏附；RASSF1A除具有调节细胞周期的作用之外，还可促进凋亡和调节微管稳定性[6]。

业已证实抑癌基因在食管癌的发生、发展中起重要作用[7]，其表遗传沉默与肿瘤侵袭、生长、新生血管生成、转移行为密切相关，可能是食管癌发生、发展以及治疗后复发的重要因素之一，并影响患者的总体生存率。多项研究证实ESCC组织中存在多种抑癌基因的高甲基化。且在癌变过程中，不同组织类型的基因甲基化状态亦不相同[8]。Zare等[9]发现44.4%的ESCC患者发生APC启动子区高甲基化，其两年生存率更低，而正常组织中未发生甲基化；Kim等[10]的研究结果显示50例ESCC患者中，APC、RARβ2、p16、RASSF1A 的 甲 基 化 率 分 别 为46%、34%、10%和 14%；Kuroki等[11]的研究发现ESCC细胞株和 ESCC组织中均可见 RARβ2、RASSF1A高甲基化，且肿瘤组织的甲基化率高于癌旁组织；Lee等[12]发现251例ESCC患者中p16、RARβ2、CDH1 的甲基化率分别为 52%、25%和43%，且CDH1高甲基化可作为TNM分期Ⅰ期患者的复发指标；Taghavi等[13]发现ESCC患者肿瘤组织p16INK4a甲基化率显著高于相邻癌旁组织。本研究中，ESCC 患者肿瘤组织中 APC、RARβ2、CDH1、p16INK4a、RASSF1A的甲基化率分别为44.7%、72.4%、72.4%、86.8%、55.3%，均显著高于相应癌旁正常组织。由此可见，各种抑癌基因甲基化可能在ESCC的发生、发展中起重要作用。

表3 ESCC患者各抑癌基因甲基化Kaplan-Meier分析

图1 CDH1和RASSF1A甲基化和非甲基化患者的生存曲线

Abbaszadegan等[14]在ESCC患者家族成员中发现，p16启动子区异常甲基化率为64.3%，而健康志愿者为0，说明p16异常甲基化可作为高危ESCC家族成员肿瘤的早期鉴别标记。本研究发现ESCC患者 APC、RARβ2、CDH1、RASSF1A 基因甲基化与肿瘤家族史显著相关，而p16INK4a基因甲基化与肿瘤家族史无关。

目前抑癌基因甲基化与ESCC患者预后关系的报道少见。本研究中，CDH1和RASSF1A甲基化患者的生存期明显低于非甲基化患者，但因随访时间过短，故不能肯定其临床意义，尚需进一步随访并重新分析才能得出可信的结果。

由此可见，对具有肿瘤家族史的健康家庭成员行多种抑癌基因甲基化检测，并密切随访甲基化阳性者，可在一定程度上早期诊断和治疗ESCC等疾病。但该结论尚需扩大样本量进一步验证。

1 张斌,曹俊,陈敏,等.死亡相关蛋白激酶基因高甲基化在胃癌形成过程中作用的初步研究.胃肠病学,2008,13(12):737-740.

2 郑秋青,凌志强,李沛,等.RASSF1A在食管鳞癌组织中的表达、甲基化状态及其与预后之间的关系.世界华人消化杂志,2010,18(29):3134-3139.

3 宋明全,常英,朱金水.质子泵抑制剂治疗对Barrett食管APC基因启动子区甲基化的影响.胃肠病学,2009,14(9):536-539.

4 许旭,孙敬岩,顾林,等.从表观遗传学角度探讨RAR-β2基因在乳腺癌发生中的作用.中国肿瘤临床,2010,37(23):1326-1329,1333.

5 孙树汉主编.遗传与疾病.第1版.北京:人民卫生出版社,2009.157-179.

6 周绍荣,徐美荣,陈云.RASSF1A基因甲基化与肿瘤关系的研究进展.实用癌症杂志,2008,23(5):540-542.

7 Raja S,Godfrey TE,Luketich JD.The role of tumor suppressor genes in esophageal cancer.Minerva Chir,2002,57(6):767-780.

8 Yang HH,Hu N,Wang C,et al.Influence of genetic background and tissue types on global DNA methylation patterns.PLoS One,2010,5(2):e9355.

9 Zare M,Jazii FR,Alivand MR,et al.Qualitative analysis of Adenomatous Polyposis Coli promoter: hypermethylation,engagementand effectson survivalof patients with esophageal cancer in a high risk region of the world,a potential molecular marker.BMC Cancer,2009,9:24.

10 Kim YT,Park JY,Jeon YK,et al.Aberrant promoter CpG island hypermethylation of the adenomatosis polyposis coli gene can serve as a good prognostic factor by affecting lymph node metastasis in squamous cell carcinoma of the esophagus.Dis Esophagus,2009,22(2):143-150.

11 Kuroki T,Trapasso F,Yendamuri S,et al.Allele loss and promoter hypermethylation of VHL, RAR-beta,RASSF1A,and FHIT tumorsuppressorgeneson chromosome 3p in esophageal squamous cell carcinoma.Cancer Res,2003,63(13):3724-3728.

12 Lee EJ,Lee BB,Han J,et al. CpG island hypermethylation of E-cadherin (CDH1)and integrin alpha4 is associated with recurrence of early stage esophageal squamous cell carcinoma.Int J Cancer,2008,123(9):2073-2079.

13 Taghavi N,Biramijamal F,Sotoudeh M,et al.p16INK4ahypermethylation and p53,p16 and MDM2 protein expression in Esophageal Squamous Cell Carcinoma.BMC Cancer,2010,10:138.

14 Abbaszadegan MR,Raziee HR,Ghafarzadegan K,et al.Aberrant p16 methylation,a possible epigenetic risk factor in familial esophageal squamous cell carcinoma.Int J Gastrointest Cancer,2005,36(1):47-54.