活化T细胞核因子和单核细胞趋化蛋白-1及该蛋白2518G/A基因多态性与冠心病的关系

杨丽霞，郭瑞威，齐峰，石燕昆，王先梅，任丽，徐安妨

动脉粥样硬化斑块形成是多种炎性因子、趋化因子及核转录因子共同参与调控的炎症网络系统。活化T细胞核因子(NFAT)是一类在炎症反应中增强基因转录调控的核转录因子，在动脉粥样硬化炎症反应的特征性细胞—单核/巨噬细胞上有NFAT的表达［1］，NFAT可能通过调控炎症因子的转录导致动脉粥样硬化炎症反应的发生。单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)是动脉粥样硬化炎症反应中的重要趋化因子，研究发现MCP-12518G/A基因多态性在冠心病尤其是急性冠状动脉(冠脉)综合征发病中发挥着重要作用［2］，但具体机制尚不明确。本研究通过测定NFAT、MCP-1浓度、MCP-12518G/A基因多态性及冠脉病变Gensini评分，分析它们与冠心病的关系。

1 资料与方法

临床资料:选择2009-01-10至2010-01-10成都军区昆明总医院心内科住院行冠脉造影的患者360例，根据造影结果确诊为冠心病的患者分为急性冠脉综合征组180例、稳定型心绞痛组120例和冠脉造影结果正常者为对照组60例。急性冠脉综合征组包括急性ST段抬高型心肌梗死60例、非ST段抬高型心肌梗死60例和不稳定型心绞痛60例。急性心肌梗死、不稳定型心绞痛、稳定型心绞痛诊断均符合美国心脏病协会/美国心脏病学会(AHA/ACC)诊断标准，冠心病诊断经冠脉造影检查至少有一支血管病变狭窄程度≥50%，不稳定型心绞痛患者同时行计算机断层摄影术血管成像(CTA)检查，病变为软斑块(计算机断层摄影术值小于50 Hu)。排除合并脑卒中、周围血管疾病或者血管栓塞性疾病、严重肝肾功能不全、感染、自身免疫疾病、哮喘及肿瘤患者。

标本处理:急性冠脉综合征组患者急诊入院时即刻采血，其余患者于入院次日清晨(空腹12 h)采血，抗凝管取肘静脉血3ml 3000 r/min离心10 min，分离血清于－80℃冰箱冻存待测。同时采肘静脉血用全自动生化仪测定总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和血糖等生化指标。

冠状动脉造影:采用Judkins法。冠脉狭窄程度的评价，采用美国 Coronary Artery Surgery Study(CASS)诊断标准和Gensini评分标准，狭窄≤25%为1分，25% ～50%为 2分，50% ～75%为 4分，75% ～90%为8分，90% ～99%为16分，100%(闭

统计学方法:用SPSS11.5统计软件分析，正态分布计量资料用表示，计量资料多组间差异比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验，MCP-1基因型计数资料采用χ2检验，服从正态分布两变量计量资料的相关性分析采用peanson’s相关系数分析，冠脉病变Gensini评分与NFAT、MCP-1-2518G/A基因多态相关性采用多元回归分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

各组间生化指标及活化T细胞核因子、单核细胞趋化蛋白-1的比较:由表1可见急性冠脉综合征组、稳定型心绞痛组NFAT、MCP-1、低密度脂蛋白胆固醇、血糖均高于对照组，而高密度脂蛋白胆固醇急性冠脉综合征组、稳定型心绞痛组均低于对照组，差异均有统计学意义(P＜0.05)。急性冠脉综合征组NFAT、MCP-1、低密度脂蛋白胆固醇均高于稳定型心绞痛组，差异均有统计学意义(P＜0.05)。经peanson’s相关分析显示，NFAT浓度与MCP-1水平呈正相关(r=0.69，P＜0.05)。图1塞)为32分。不同节段冠脉评分系数按Gensini标准，狭窄程度评分再乘以一个标志病变位置，左主干×5;左前降支近段×2.5;中段×1.5;远段×1;第一对角支×1;第二对角支×0.5;左回旋支近段×2.5，远段和后降支、钝缘支均×1，后侧支×0.5;右冠近、中、远段和后降支均×1，每例患者冠脉病变程度的最终积分为各分支积分之和。

酶联免疫吸附(ELISA)法测定活化T细胞核因子、单核细胞趋化蛋白-1水平:NFAT试剂盒、MCP-1试剂盒购自大连泛邦生物工程有限公司，操作步骤严格按照说明书进行。

单核细胞趋化蛋白-1基因多态性检测:①脱氧核糖核酸(DNA)的制备，严格按照DNA提取试剂盒说明书提取 DNA，试剂盒购自北京 TIANGEN公司。②多聚酶链反应(PCR)扩增采用引物的序列［2］:上游引物:5'-CCGAGATGTTCCCAGCACAG-3'，下游引物:5'-CTGCTTTGTTTGTGCCTCTT-3'。反应条件:94℃预变性 5 min，94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，31个循环，72℃延伸10 min。限制性内切酶PvuⅡ对PCR扩增产物在37℃下进行酶切。取6 μl酶切产物在2%琼脂糖凝胶上进行电泳，紫外灯下观察、拍照及分析。

表1 冠心病各组间活化T细胞核因子、单核细胞趋化蛋白-1浓度及其他生化指标比较()

表1 冠心病各组间活化T细胞核因子、单核细胞趋化蛋白-1浓度及其他生化指标比较()

注:与对照组比较*P＜0.05;与稳定型心绞痛组比较△P＜0.05。NFAT:活化T细胞核因子 MCP-1:单核细胞趋化蛋白-1 LDL-C:低密度脂蛋白胆固醇 HDL-C:高密度脂蛋白胆固醇

例数 NFAT(pg/ml)MCP-1(pg/ml)LDL-C(mmol/L)HDL-C(mmol/L)血糖(mmol/L)对照组 60 25.92±3.91 112.52±9.95 2.53±0.25 1.40±0.33 4.89±0.77稳定型心绞痛组 120 28.48±3.81* 127.24±14.53* 2.79±0.38* 1.27±0.27* 6.25±1.83*急性冠脉综合征组 180 31.96±4.49＊△ 149.47±18.10＊△ 2.97±0.35＊△ 1.12±0.13* 6.98±2.19*

图1 活化T细胞核因子和单核细胞趋化蛋白-1的关系散点图

活化T细胞核因子、单核细胞趋化蛋白-1与冠脉病变Genisini评分多元逐步回归分析:以冠脉病变Gensini评分为应变量，以各危险因素为自变量进行多元逐步回归分析，有五个因素进入回归方程，依次为高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、血糖、NFAT、MCP-1，结果显示冠脉病变 Gensini评分与NFAT、MCP-1、血糖、低密度脂蛋白胆固醇水平呈正相关，与高密度脂蛋白胆固醇呈负相关(t值=－4.08)。表2

表2 各因素与冠状动脉病变Gensini评分多元逐步回归分析

单核细胞趋化蛋白-1基因多态性分析:图2可见，GG纯合子酶切为708 bp和222 bp两种片段;AG杂合子酶切后为930 bp、708 bp和222 bp三种片段;若为AA纯合子则因无酶切位点而仅显示930 bp一种片段。

图2 单核细胞趋化蛋白-12518位点PVUⅡ酶切图M:分子量标记 图中AG、GG、AA为基因型

三种类型基因间单核细胞趋化蛋白-1浓度比较及各组基因型及等位基因频率分布:MCP-1浓度在GG型基因为(152.69±21.78)pg/ml高于AG型基因(136.16±18.15)pg/ml，AG型基因高于 AA型基因(123.66±14.92)pg/ml，三种类型基因比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。各基因型间性别、年龄、体重、血糖、血脂比较差异均无统计学差异。MCP-1基因多态及等位基因频率在冠心病患者(急性冠脉综合征组、稳定型心绞痛组)及对照组分布符合 Hardy-Weinberg遗传平衡规律，表3各组单核细胞趋化蛋白-1基因型及等位基因频率分布可见，急性冠脉综合征组GG型基因和G等位基因频率较稳定型心绞痛组及对照组增高，差异均有统计学意义(P＜0.05)。

表3 各组单核细胞趋化蛋白-1基因型及等位基因频率分布

3 讨论

作为体内重要核转录因子，NFAT是参与机体免疫反应细胞因子基因转录的调控，众多细胞因子基因调控区有NFAT的结合位点，NFAT能与锌指结构(bZIP)结合为协同复合体，形成一延伸的接触面，从而促进基因的转录过程［3］。我们分析了NFAT与冠心病的相关性及它与 MCP-1之间的联系，结果显示，血清NFAT水平在急性冠脉综合征组较稳定型心绞痛组升高，稳定型心绞痛组较对照组升高，GS评分结果也表明NFAT与冠脉病变狭窄程度相关，提示NFAT也可能是参与冠心病的发病的一个核转录因子。

MCP-1特异作用于单核/巨噬细胞，激活启动炎症反应，有研究结果显示冠心病多种危险因素血糖、血脂代谢异常、氧化应激均能引起 MCP-1 升高［4，5］，MCP-1作用于其特异受体一方面能激活单核细胞使细胞内Ca2+浓度增加和呼吸爆发，释放溶酶体酶形成脂质池不断引起动脉粥样硬化斑块纤维帽变薄破裂［6，7］;另一方面 MCP-1还能激活单核细胞内丝裂素激酶级联反应，介导多种转录因子、炎性细胞因子、基质金属蛋白酶等活化导致斑块破裂［8］。因此MCP-1在动脉粥样硬化炎症反应及急性冠脉综合征易损斑块的进展及破裂的过程中发挥有重要作用，我们对MCP-1与冠心病的相关性研究结果显示，血清MCP-1水平在急性冠脉综合征组较稳定型心绞痛组升高，稳定型心绞痛组较对照组升高，显示MCP-1在冠心病及急性冠脉综合征发病中发挥有重要作用。而且冠脉病变Genisini评分也与MCP-1水平呈正相关，这表明MCP-1水平与冠心病严重程度有一定的联系。

MCP-12518G/A位点位于MCP-1基因启动子区域，此处突变导致的AG、GG型基因可能增加启动子区域内的GC盒子，而GC盒是在MCP-1启动子近端调控区上特异结合刺激蛋白-1增强转录的靶点，最终引起MCP-1蛋白表达水平的增高［9］。在我们的研究中，MCP-1水平在三种不同基因型中分析表明GG型较AG型升高，AG型较AA型升高，说明不同基因型冠心病患者MCP-1水平存在差异，不同基因型可能调控MCP-1的表达。Szalai等［10］研究了318例冠心病患者，认为MCP-12518G/A的变异可能是冠心病易感发病的遗传危险因素。Mcderotte等［11］发现该位点基因多态性与缺血性心脏病相关。Jemaa等［12］近期的研究提示MCP-1基因的2518G/A多态性与心肌梗死相关。我们的研究结果显示MCP-12518G/A基因多态性在急性冠脉综合征组GG型基因和G等位基因频率分布较稳定型心绞痛组及对照组升高，AA型基因和A等位基因频率分布较稳定型心绞痛组及对照组降低。这表明GG型基因及G型等位基因与冠心病的严重程度相关，GG型基因及G型等位基因在冠心病尤其是急性冠脉综合征易损斑块炎症反应中可能发挥重要作用。

综上所述，NFAT与MCP-1的血浆浓度与冠心病发病有相关性，可能成为冠心病的预测指标，并且MCP-12518G/A基因多态性与冠脉病变严重程度也明显相关。

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