18种活血化瘀中药对FactorⅩa的抑制作用

沈舒，王琼，赵鑫，陈彩娟，李友宾

(1.南京中医药大学，江苏 南京 210046;2.江苏省中医药研究院，江苏 南京 210028;3.中国药科大学，江苏 南京 210009)

凝血因子Ⅹa(FactorⅩa，FⅩa)是一种丝氨酸蛋白酶，在凝血级联反应中参与形成凝血酶原复合物(包括FⅩa、FⅤa、凝血酶原以及 Ca2+)，催化凝血酶原转变为凝血酶。凝血酶则促使纤维蛋白原转变为纤维蛋白，激活血小板以及其他凝血因子(FⅤa、FⅤⅢa和FⅩⅢa)，发挥凝血作用。在凝血级联反应中，每步酶解过程均具有放大效应，抑制FⅩa，可以在不影响已有凝血酶的情况下减少催化过程中大量产生的凝血酶，既发挥抗血栓作用，又保证了正常的止血功能［1］，因此，FⅩa成为目前抗血栓治疗的重要靶点。活血化瘀中药有悠久的使用历史和确切的活血功效［2］，通过查阅相关文献发现，不少活血化瘀中药对反映外源性和内源性凝血途径的凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血酶时间(APTT)同时有延长作用，推测其中可能存在具有抑制FⅩa作用的种类。由此，对18种活血化瘀中药进行了抑制FⅩa活性的筛选实验。

1 仪器与材料

NANODROP 1000分光光度计(Thermo，US);梅特勒万分之一电子天平;Purified FⅩa、生色底物BIOPHEN CS－11(22)(HYPHEN BioMed，批号分别为EZ007K、229015);拜瑞妥(Bayer AG，批号 BXFD8J1);其余试剂均为分析纯。药材于2010年8月购自江苏省中西医结合医院中药房，经江苏省中医药研究院李友宾博士鉴定，凭证标本存于江苏省中医药研究院中药化学研究室。

2 实验方法

2.1 样品制备

将18味中药饮片粉碎，各称取5g，加7倍量的甲醇超声提取2次，每次1h，合并提取液，浓缩成浸膏。用DMSO溶解浸膏，制成50mg/mL的样品溶液。

2.2 FⅩa活性检测

反应液包括磷酸盐缓冲液(pH=8.34，含0.300M NaCl，0.065 0M Na2HPO4，0.001 67M KH2PO4)20μL，FⅩa溶液(2.5μg/mL)20μL，样品溶液0.2μL，于 37℃温育30min后加入底物溶液(2.5mg/mL)20μL，开始反应。对照组以溶剂DMSO代替样品溶液，空白组以缓冲液代替FⅩa溶液。反应开始后分别测量反应体系第0.5～5min在405nm处的吸光度，每0.5min测1次。通过连续速率法，将所测得的吸光度(A)对时间(T)做回归曲线，曲线的斜率代表了酶反应的速度，反应了酶的活性，与对照组的回归曲线斜率相比则可反映抑制剂对酶抑制作用的强弱。

对照组的回归曲线斜率为Vi，样品组的回归曲线斜率为 V0，样品的抑制率(I%)=(Vi－ V0)/Vi［2－3］。

表1 各活血化瘀中药对FⅩa的抑制作用(n=2)

3 结果与讨论

18种活血化瘀中药抑制FⅩa活性的实验结果见表1。可以看出所筛选的18种活血化瘀中药提取物在50mg/ml的浓度下，有6种对FⅩa的抑制活性超过50%，4种抑制活性超过30%，其它种类则抑制作用较弱。目前世界各国许多科学家致力于寻找高效、低毒、专一、可口服的FⅩa抑制剂，主要以合成的小分子化合物为主［4－5］，也有从嗜血性无脊椎动物体内分离到多肽类物质［6］。中医学运用活血化瘀药治疗血瘀证有上千年的历史，从中寻找高效低毒专一的FⅩa抑制剂具有很大优势。我们正在对其中的几种中药进一步分离纯化，以期获得对FⅩa抑制活性较强的单体化合物。

［1］Roehrig S，Straub A，Pohlmann J，et al.Discovery of the novel antithrombotic agent 5－Cholro－N－({(5S)－2－oxo－3－［4－(3－oxomorpholin－4－yl)phenyl］－1，3－oxazolidin－5－yl}methyl)thiophene－2－carboxamide(BYA 59－7939):An oral，direct Factor Ⅹa inhibitor［J］.J Med Chem，2005，48，5900－5908.

［2］高忠明.活血化瘀中药协同治疗脑梗死的临床疗效观察［J］.中医药学报，2011，39(2):47－50.

［3］李洁璇，张晓雪，王银叶.新型多肽bg11522体外对活化凝血因子Ⅹ的抑制作用［J］.中国新药杂志，2008，17(8):656－660.

［4］Chu V，Brown K，Colussi D，et al.In vitrocharacterization of a novel Factor Ⅹa inhibitor，RPR 130737［J］.Thromb Res，2000，99(1):71－82.

［5］刘晓，崔一民.新型抗凝血药物—利伐沙班［J］.中国药房，2010，21(1):83－85.

［6］Kaiser B.DX－9065a，a Direct Inhibitor of FactorⅩa［J］.Cardiovascular Drug Reviews，2003，21(2):91－104.

［7］蒋香梅.嗜血性无脊椎动物的天然凝血因子Ⅹa抑制物［J］.动物医学进展，2006，27(1):31－35.