不同外源寡糖对崂山奶山羊瘤胃微生物区系的影响

祁 茹温建新程 明汪文鑫肖 宇褚永康林英庭*

(1.青岛农业大学动物科技学院，青岛 266109;2.青岛市畜牧兽医研究所，青岛 266100)

外源寡糖(又称低聚糖)作为一种新型的微生态饲料添加剂，用量少、纯天然、无残留且稳定性强，具有吸附肠道病原菌和发挥免疫调节作用的双重功能，最有可能成为抗生素的替代品。目前国内外关于寡糖添加效果的报道不一。Davis等［4］和 Pettigrew［5］研究发现，甘露寡糖(mannoseoligosaccharides)在猪体内如同其他抗菌生长促进剂一样有效，然而也有报道认为并无该效果［6－8］。Liu等［9］报道壳聚糖(饲粮添加160 mg/kg)有降低断奶仔猪腹泻率、抑制大肠杆菌生长的功效，但不能有效替代抗生素作为断奶仔猪生长促进剂使用。Dimitroglou等［10］报道，MOS调节虹鳟鱼肠道微生物群落，进而作用于肠道形态和上皮细胞刷状缘。王新峰等［2］研究寡糖对断奶羔羊瘤胃菌群的影响，结果表明寡糖能够改变断奶羔羊瘤胃菌群结构，其中果寡糖(fructo-oligosaccharides)(饲粮添加0.3%)对羔羊瘤胃液细菌总数以及黄化瘤胃球菌(R.Flavefaciens)和琥珀酸丝状杆菌(F.Succinogenes)数量均有提高作用。外源寡糖在奶山羊的报道较少，关于比较不同外源寡糖作用效果的研究亦极少。因此，本试验通过在饲粮中添加不同外源寡糖，研究其对瘤胃微生物区系的影响，筛选和确定奶山羊用寡糖，为外源寡糖应用于奶山羊养殖提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

甘露寡糖(纯度50%)、半乳甘露寡糖(galactomannan-oligosaccharides，纯 度 80%)、寡 木 糖(xylo-oligosaccharides，纯度70%)、低聚异麦芽寡糖(isomalto-oligosaccharides，纯度 90%)、果寡糖(纯度90%)均为商业产品。

1.2 试验动物及分组

选用体况良好、平均体重(32.80 ±2.45)kg、安装有永久性瘤胃瘘管的6月龄去势崂山奶山羊6只，进行编号。采用分期分组试验设计，试验共4期，每期奶山羊分别饲喂基础饲粮以及基础饲粮中添加1%(以有效含量计)不同外源寡糖的试验饲粮，按添加寡糖的种类将各期中的试羊分配到6组，试验动物分组见表1。每期23 d，其中预试期14 d，正试期 9 d。

1.3 基础饲粮

基础饲粮配制参照中国肉用山羊饲养标准(NY/T 816—2004)［11］，基础饲粮组成及营养水平见表2。

表1 试验动物分组Table 1 Grouping of experimental animals

表2 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)Table 2 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

1.4 饲养管理

试验期间奶山羊单栏饲养，每天07：00和17：00分2次等量饲喂，先精后粗，精饲料425 g/d，粗饲料1 000 g/d，自由饮水，各组间饲养管理完全一致。

1.5 瘤胃内容物的采集和预处理

瘤胃内容物的采集时间如下：正试期第1天07：00(0 h)、13：00(6 h);第 5 天 09：00(2 h)、15：00(8 h);第 9 天 11：00(4 h)、17：00(10 h)。

由瘤胃瘘管采集不同位点的瘤胃内容物，立刻用4层纱布过滤，取5 mL装入充有CO2气体的离心管，在超净工作台中梯度稀释并接种培养，用于瘤胃液单位体积内细菌、真菌、纤维素分解菌的计数。再取1 mL加入4 mL甲基绿染色液(MFS)中固定，以备镜检原虫数。

1.6 细菌、真菌、纤维素分解菌和原虫的计数

1.6.1 细菌、真菌、纤维素分解菌计数

细菌、真菌、纤维素分解菌采用固体培养基培养后计数，参照Hungate［12］的滚管法进行。

1.6.2 原虫计数

原虫计数参照《现代反刍动物营养研究方法和技术》［13］进行。

1.7 数据处理

数据处理及统计分析应用SPSS 17.0统计分析软件中的One-way ANOVA进行方差分析，LSD进行多重比较，采用回归的曲线估计进行回归分析。结果均以平均值±标准差表示。

2 结果

2.1 不同外源寡糖对瘤胃液细菌总数的影响

由表3可知，与对照组相比，瘤胃液单位体积内细菌总数在晨饲前(0 h)仅MOS组显著提高(P＜0.05)，其余试验组有提高的趋势，但未达到显著水平(P＞0.05);各试验组细菌总数在晨饲后2 h降到最低，所有组均在晨饲后4 h达到峰值，然后缓慢下降，趋于平衡。在整个试验期内，MOS组、FOS组的瘤胃液单位体积内细菌总数处于较高水平。

2.2 不同外源寡糖对瘤胃液纤维素分解菌数量的影响

由表4可知，晨饲前MOS组瘤胃液单位体积内纤维素分解菌数量较对照组显著提高(P＜0.05);GMOS组、FOS组在晨饲前，晨饲后 2、4 h均显著高于对照组和其他试验组(P＜0.05)，它们之间差异不显著(P＞0.05)。各组均出现先升高后降低的趋势，晨饲后4 h达到峰值，然后逐渐降低。整个试验期内，GMOS组、FOS组的瘤胃液单位体积内纤维素分解菌数量一直处于较高水平。

表3 不同外源寡糖对瘤胃液细菌总数动态变化的影响Table 3 Effects of different exogenous oligosaccharides on the dynamic change of number of total bacteria in rumen liquid 109CFU/mL

表4 不同外源寡糖对瘤胃液纤维素分解菌数量动态变化的影响Table 4 Effects of different exogenous oligosaccharides on the dynamic change of number of rumen liquid cellulose-decomposing bacteria 108CFU/mL

由表5可知，瘤胃液单位体积内纤维素分解菌数量和时间的回归关系符合二次曲线模型，各试验组的瘤胃液单位体积内纤维素分解菌数量极小值均高于对照组，提示饲粮中添加外源寡糖可以提高奶山羊瘤胃液单位体积内纤维素分解菌数量。GMOS组和FOS组取极小值时的时间(即对称轴数值)均高于对照组，提示添加半乳甘露寡糖和果寡糖延迟了瘤胃液单位体积内纤维素分解菌到达峰值的时间，即增加了较高浓度纤维素分解菌作用于瘤胃内容物的时间，且极小值也高于对照组。

表5 瘤胃液纤维素分解菌数量与时间的回归分析Table 5 The regression analysis of number of rumen liquid cellulose-decomposing bacteria and time

2.3 不同外源寡糖对瘤胃液原虫数量的影响

由表6可知，与对照组瘤胃液单位体积内原虫数量相比，MOS组在晨饲后2和4 h、XOS组在晨饲后4 h均显著增加(P＜0.05);整个试验期内，MOS组瘤胃液原虫数量处于较高水平;各组原虫数量呈先下降后上升趋势，晨饲后2 h下降到最低点，之后开始上升，MOS组和XOS组晨饲后4 h达到峰值，其余组到晨饲后6 h达到峰值，之后逐渐下降或趋于平衡。晚饲前(晨饲后10 h)瘤胃液原虫数量恢复到和晨饲前同一水平。

表6 不同外源寡糖对瘤胃液原虫数量动态变化的影响Table 6 Effects of different exogenous oligosaccharides on the dynamic change of number of rumen liquid protozoa 105CFU/mL

由表7可知，瘤胃液单位体积内原虫数量和时间的回归关系符合二次曲线模型，各试验组的瘤胃液原虫数量极大值均高于对照组，即饲粮中添加外源寡糖可以提高奶山羊瘤胃液原虫数量。

2.4 不同外源寡糖对瘤胃液真菌数量的影响

由表8可知，与对照组瘤胃液单位体积内真菌数量相比，晨饲前GMOS组(P＜0.01)和FOS组(P ＜0.01)，晨饲后 2 h MOS组(P ＜0.05)、IMO 组(P ＜0.05)、FOS组(P ＜0.05)，晨喂后4 h MOS组(P ＜0.05)，晨饲后6 h FOS组(P ＜0.05)均有显著提高。各试验组瘤胃液真菌数量在晨饲后呈上升趋势，到4 h达到峰值，然后逐渐下降，在晨饲后8 h略有升高，而后晚饲前有所降低。在整个试验期内，MOS组、FOS组的瘤胃液真菌数量在各试验组间均一直处于较高水平。

表7 瘤胃液原虫数量与时间的回归分析Table 7 The regression analysis of number of rumen liquid protozoa and time

表8 不同外源寡糖对瘤胃液真菌数量动态变化的影响Table 8 Effects of different exogenous oligosaccharides on the dynamic change of number of rumen liquid fungi 105CFU/mL

从表9可知，瘤胃液单位体积内真菌数量和时间的回归关系符合二次曲线模型，各试验组回归方程的对称轴数值均大于对照组，且极小值均高于对照组，提示添加外源寡糖可以延迟瘤胃液真菌数量到达峰值的时间，从而使较高浓度真菌作用于瘤胃内容物的时间增加，且到达峰值的极小值大于对照组的极小值。除MOS组外各试验组二次项系数均大于对照组，即二次曲线的开口较对照组小。

表9 瘤胃液真菌数量与时间的回归分析Table 9 The regression analysis of number of rumen liquid fungi and time

3 讨论

3.1 不同外源寡糖对瘤胃液细菌总数的影响

本试验条件下，瘤胃液单位体积内细菌总数分布于8.82×109～10.25×109CFU/mL 之间，属正常范围(109～1010CFU/mL)［12］，饲粮添加外源寡糖有提高奶山羊瘤胃液单位体积内细菌总数的趋势，但未达到显著性水平。这与张学峰［14］报道的外源性寡糖对瘤胃液细菌总数没有产生显著性影响的结果相一致。外源寡糖可以为瘤胃液细菌提供更多可利用的碳水化合物从而促进其增殖，此外，外源寡糖也可以有效改善瘤胃发酵功能［16］，但不同外源寡糖对瘤胃微生物的增殖效果不同，目前尚无外源寡糖促进瘤胃液细菌增殖机理的定论，有待进一步研究探讨。

影响瘤胃液单位体积内细菌总数的因素很多，除饲粮结构外，还有饲喂频率、饲喂水平、取样时间以及动物的个体差异等。但总的来说，细菌总数随摄入可利用能量的上升而增加。Leedle等［15］报道，在各种饲粮的维持水平条件下瘤胃液细菌总数是比较稳定的，可培养细菌的数量在饲喂后减少到40% ～60%(2或4 h降到最低)。本试验结果显示瘤胃液单位体积内细菌总数在饲喂后2 h降到最低，饲喂后4 h达到峰值，然后缓慢下降，趋于平衡。原因可能是奶山羊进食后，大量饲料、唾液和饮水进入瘤胃稀释了原有的瘤胃液，细菌密度下降，即单位体积内瘤胃液中所含的细菌总数降低;由于进食造成奶山羊瘤胃内环境发生改变，减缓或抑制了细菌在短时间内的增殖;进食2～4 h内，瘤胃微生物利用进食饲料中的营养物质迅速增殖而达到峰值;之后随着可利用营养物质的消耗以及瘤胃内环境包括pH、氧化－还原电位、二氧化碳分压、温度等的逐渐稳定，瘤胃液细菌浓度又逐渐下降，之后趋于动态平衡。薛峰［17］报道瘤胃液细菌总数从饲喂前到饲喂后2 h呈下降趋势，在2 h到达最低点之后，逐渐上升到饲喂后4 h达最高值。这与本试验结果基本一致。

3.2 不同外源寡糖对瘤胃液纤维素分解菌数量的影响

粗饲料是反刍动物主要的饲料来源，细菌和真菌在分解利用纤维素过程中起主要作用，其中纤维素分解菌扮演重要角色［18］。本试验结果表明，不同外源寡糖提高奶山羊瘤胃液单位体积内纤维素分解菌数量的效果不同，其中半乳甘露寡糖和果寡糖达到显著水平。这与外源寡糖的生理生化功能息息相关，外源寡糖可以提高营养物质瘤胃降解率，还可以通过降低瘤胃液pH、氨态氮(NH3-N)浓度等改善瘤胃内环境，利于瘤胃纤维素分解菌的生长和增殖。不同外源寡糖对奶山羊瘤胃液单位体积内纤维素分解菌数量影响不同，这与寡糖的结构、理化性质和纯度等有关。王新峰等［2］报道果寡糖能够使黄化瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌的数量提高，而添加低聚异麦芽糖和混合添加2种寡糖对羔羊瘤胃液细菌总数和2种纤维降解菌的数量均有一定的抑制作用，特别是产琥珀酸丝状杆菌，达到了显著水平。

3.3 不同外源寡糖对瘤胃液原虫数量的影响

大量体内体外试验都表明，原虫直接参与降解细胞壁多糖的过程［20］。原虫数量变化趋势可以间接反映纤维素的消化情况。本试验条件下，瘤胃液单位体积内原虫数量分布于4.65×105～5.08×105CFU/mL 之间，属正常范围(105～106CFU/mL)［12］。

原虫不能利用简单的含氮化合物合成自身所需要的氨基，其生长必须靠吞噬细菌获得氨基酸，合成自身蛋白质［21］。本试验条件下，外源寡糖对细菌总数无显著性影响，而甘露寡糖显著提高了奶山羊瘤胃液单位体积内原虫数量。推测一方面可能是甘露寡糖促进了饲料中蛋白质的分解，使得原虫的蛋白质来源增多，从而数量增多;另一方面可能由于甘露寡糖改善瘤胃内环境利于原虫增殖的效果优于其他外源寡糖。前人研究结果显示，甘露寡糖在单胃动物和反刍动物中应用效果良好。White等［22］报道，甘露寡糖可以有效抑制大肠杆菌在十二指肠、空肠、盲肠和结肠的定植，改善断奶仔猪肠道健康状况。鲍延安等［23］报道，甘露寡糖可以显著降低中国荷斯坦奶牛体细胞数。整个试验期内，瘤胃液单位体积内原虫数量呈先下降后上升趋势，这与张学峰［14］报道的原虫数量在晨饲后4 h达到最低点，随后逐渐升高，在晨饲后12 h达到峰值水平略有差异。原因可能是试验所用的寡糖种类、饲喂方式及试验动物等存在差异。

3.4 不同外源寡糖对瘤胃液真菌数量的影响

瘤胃液厌氧真菌中的绝大部分种属都能分解纤维素，都具有广泛的高活性的降解植物细胞壁的纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶和酯酶。瘤胃液厌氧真菌的数量和生物量的估计对于了解厌氧真菌在瘤胃内的定量以及在瘤胃内的自然变异规律非常重要。因此本试验选择运用滚管法计数瘤胃液单位体积内真菌数量，作为分析厌氧真菌在瘤胃内变化规律的指标。

本试验条件下，各组真菌数量分布于4.48×105～6.02×105CFU/mL之间，均在报道的正常真菌数量范围(103～ 105CFU/mL)内［24－25］，且甘露寡糖和果寡糖显著提高奶山羊瘤胃液单位体积内真菌数量。分析原因可能是：真菌生长所需的氮源为和氨基酸形式的氮，外源寡糖可以降低瘤胃NH3-N浓度和pH。瘤胃液单位体积内真菌数量与瘤胃内环境息息相关，当瘤胃处于真菌生长的最佳状态时，其增殖速度加快，数量则相应增加。戈婷婷等［3］报道饲粮中添加甘露寡糖可以显著提高培养液中(微生物蛋白)MCP含量、增加瘤胃产气量、降低NH3-N浓度。凌宝明等［16］报道灌注果寡糖可以降低生长绵羊的瘤胃液pH、NH3-N浓度，提高挥发性脂肪酸(VFA)含量和瘤胃液MCP浓度。

本试验条件下，瘤胃液厌氧真菌数量自晨饲起开始上升，到饲喂后4 h达到峰值，这与原虫的存在及外源寡糖的添加存在必然联系。表6显示，添加外源寡糖可以提高瘤胃液单位体积内原虫数量。瘤胃液中原虫的存在能够增加饲料在瘤胃中的滞留时间，并且能够稳定瘤胃环境，这有益于厌氧真菌的形成［26］，但其机理有待进一步探讨。

4 结论

①饲粮添加外源寡糖有提高奶山羊瘤胃液单位体积内细菌总数的趋势，但无显著性影响。

②半乳甘露寡糖和果寡糖可以显著提高奶山羊瘤胃液纤维素分解菌数量。

③甘露寡糖可以显著提高奶山羊瘤胃液原虫数量。

④甘露寡糖和果寡糖可以显著提高奶山羊瘤胃液真菌数量。

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