京大戟醋制前后大戟二烯醇和甘遂甾醇的变化

曹雨诞， 耿欣欣， 陈海鹰， 张 丽

(南京中医药大学，江苏南京210046)

京大戟为大戟科植物大戟Euphorbia pekinensis Rupr.的干燥根［1］，具有泻水逐饮、消肿散结的功效。其性寒，味苦，有毒;由于其生品毒性较大，故临床上常用其炮制品。历版中国药典均采用醋制来降低京大戟的毒性［2］，但有关其醋制减毒的物质基础研究报道相对较少。有研究表明，京大戟根中二萜、三萜类成分可能为其毒性成分［3］，而大戟二烯醇和甘遂甾醇均为三萜类成分［4］。因此本实验以京大戟中指标性成分大戟二烯醇［5］和甘遂甾醇为指标，采用高效液相色谱法［5-6］考察京大戟醋制前后大戟二烯醇和甘遂甾醇的变化，为进一步研究京大戟醋制减毒物质基础和作用机理提供参考。

1 仪器和试药

1.1 仪器 Waters2695高效液相色谱系统 (2489紫外/可见检测器，Empower色谱工作站)，FW-100高速万能粉碎机 (天津市泰斯特仪器有限公司)，FA1104N电子天平 (d=0.1mg，上海精密科学仪器有限公司)，DL—I—15台式封闭电炉 (天津市泰斯特仪器有限公司)，BP211D电子天平 (d=0.01mg，德国赛多利斯)，KQ—500型超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公司)，HH-S恒温水浴锅 (江苏国胜实验仪器厂)，Anke TGL—16B型离心机 (上海安亭科学仪器厂)。

1.2 试药 京大戟药材采购自安徽省亳州市药材总公司，经南京中医药大学乐巍副教授鉴定为大戟科植物大戟 Euphorbia pekinensis Rupr.的干燥块根。京大戟生品 (取生京大戟饮片，除去杂质，大小分档，打粉);京大戟醋制品 (取生京大戟数个，大小分档后，加30%量食醋拌匀，浸润;加入纯净水，文火煮沸，煮至醋被吸尽;取出，室温晾干，40℃烘箱干燥;打粉)。

大戟二烯醇和甘遂甾醇对照品 (自制，纯度经HPLC归一化法测定大于98%)，乙腈 (色谱纯)，甲醇 (色谱纯)，水为娃哈哈纯净水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent XDB C8色谱柱 (150 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈-水 (93 ∶7)，体积流量 1.0 mL/min，柱温30℃，检测波长210 nm，进样量10 μL。色谱图见图1。

图1 HPLC图谱Fig.1 HPLC chromatograms

2.2 对照品溶液的制备 精密称取减压干燥至恒定质量的大戟二烯醇对照品52.44 mg和甘遂甾醇对照品21.32 mg，分别置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，即得对照品贮备溶液。再分别精密吸取上述对照品贮备溶液1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀，即得混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备 取京大戟生品和醋制品粉 (过65目筛)约0.5 g，精密称定，置50 mL具塞锥形瓶中，精密加入乙酸乙酯25 mL，密塞，称定质量，超声处理 (功率250 W，频率50 kHz)40 min，再次称定，用乙酸乙酯补足损失的质量，摇匀，滤过。精密量取续滤液10 mL，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解，并转移至10 mL量瓶中，稀释至刻度，摇匀，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 精密吸取上述混合对照品溶液1、2、5、10、20 μL，按 2.1项下色谱条件进样测定，以峰面积值Y为纵坐标，进样量X为横坐标，绘制标准曲线，分别计算大戟二烯醇和甘遂甾醇回归方程:Y=394058.8X－38209.7(r=0.9999)，Y=174098.5X+30030.5(r=0.9998)。结果表明大戟二烯醇在进样量0.5244～10.4880 μg范围内，甘遂甾醇在进样量0.2132～4.264 μg范围内与峰面积呈良好线性关系。

2.4.2 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液10 μL，重复进样6次，按2.1项下色谱条件，测定峰面积，结果大戟二烯醇和甘遂甾醇的RSD分别为0.62%和0.45%，表明该方法的精密度良好。

2.4.3 重复性试验 精密称取京大戟醋制品约0.5 g，平行6份，按照2.3项下方法制备供试品溶液，依法测定，得大戟二烯醇和甘遂甾醇的RSD分别为0.83%和0.72%。结果表明该方法的重复性良好。

2.4.4 稳定性试验 取同一京大戟醋制品供试品溶液，分别于0、2、4、6、8 h进样测定，得大戟二烯醇和甘遂甾醇峰面积的RSD分别为1.28%和1.26%，表明供试品溶液在8 h内稳定性良好。

2.4.5 加样回收率试验 精密称取已知含有量的醋制京大戟粉末6份，每份0.25 g，精密加入对照品贮备溶液各0.5 mL，按2.3项下制成供试品溶液，依法测定，计算回收率。得大戟二烯醇的加样回收率为97.36%，RSD为1.07%;甘遂甾醇的加样回收率为98.72%，RSD为0.77%。结果见表1和表2。

表1 大戟二烯醇的加样回收率试验Tab.1 Recovery test of euphol

表2 甘遂甾醇的加样回收率试验Tab.2 Recovery test of tirucallol

2.5 样品测定 取京大戟生品和京大戟醋品按2.3项下供试品溶液的制备方法依法制备，以平均峰面积，采用标准曲线法利用回归方程计算大戟二烯醇和甘遂甾醇的含有量，测定结果见表3。

表3 京大戟醋制前后大戟二烯醇和甘遂甾醇的比较(n=3)Tab.3 Comparison of euphol and tirucallol contents for crude Euphorbiae Pekinensis Radix before and after processing with vinegar(n=3)

3 讨论

3.1 根据相关文献 ［5-7］，选择了不同溶剂 (甲醇﹑乙醇及乙酸乙酯)超声提取，同时又考察了提取时间，结果表明，样品用乙酸乙酯超声提取40 min效果最佳。

3.2 由于大戟二烯醇和甘遂甾醇在210 nm处有最大吸收，故检测波长选择为210 nm，使得各成分在其最大吸收波长下进行测定，从而提高了分析精度，保证了方法稳定性。采用Agilent XDB C8色谱柱 (150 mm×4.6 mm，5 μm)，以乙腈-水、甲醇-水为流动相，按不同比例进行测定，发现以乙腈-水 (93∶7)色谱系统能把大戟二烯醇与其同分异构体甘遂甾醇获得较好的分离效果。

3.3 有研究表明，大戟二烯醇对人正常肝细胞和人正常胃黏膜上皮细胞均有一定的增殖抑制作用［8］，当京大戟醋制后其含有量略有降低［9-10］。本实验考察了京大戟醋制前后三萜类成分大戟二烯醇和甘遂甾醇的变化，结果发现大戟二烯醇和甘遂甾醇经醋制后含有量都有降低，这可能是由于在醋制过程中加入了水，加速了萜类化合物的分解，降低了京大戟的毒性。上述实验结果为后续京大戟醋制减毒物质基础和作用机理的深入研究提供了依据。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版一部［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:208.

［2］张乐林，孙立立.京大戟现代研究概述［J］.中华中医药学刊，2011，29(3):577-579.

［3］Singh G B，Singh S，Sharma M L，et al.Hypotensive activity of 8，24-euphadien-3β-ol(euphol)［J］.Planta Medica，1989，55(6):500.

［4］梁侨丽，戴传超，吴启南，等.京大戟的化学成分研究［J］.中草药，2008，39(12):1779-1781.

［5］麻风华，姜文红，哈丽丽，等.RP-HPLC法测定京大戟中大戟二烯醇的含量［J］.药物分析杂志，2010，30(12):2290-2292.

［6］高 羽，梁侨丽，戴传超，等.大戟属4种植物中大戟二烯醇的含量测定［J］.时珍国医国药，2010，21(5):1051-1052.

［7］李 媛，张 丽，单鸣秋，等.正交试验优选甘遂醋制最佳工艺［J］.中国实验方剂学杂志，2011，17(7):4-6.

［8］ 李征军.甘遂化学成分及毒性评价研究［D］.南京:南京中医药大学，2012:58-61.

［9］曹雨诞，陈海鹰，颜晓静，等.不同醋制法对京大戟中大戟醇含量的影响［C］.中华中医药学会中药炮制论文集，贵州，2011:197-201.

［10］邱韵萦，郁红礼，吴 皓，等.京大戟和甘遂炮制前后大戟二烯醇的含量比较［J］.中国药房，2012，23(11):1031-1033.