基于直列式交错微电极阵列的细胞电融合*

郑小林，鄢佳文，胡 宁，杨 军，杨 静

（1.重庆大学生物工程学院，重庆 400030;2.重庆通信学院军事信息工程系，重庆 400035）

0 引言

细胞电融合利用强电场诱导2个或者多个细胞通过无性方式融合［1］。融合子包含来自不同亲代细胞的遗传物质，从而表现出新的遗传特性。该方法有助于培养新的物种、品系或细胞工程产品。相对于生物诱导和化学诱导等传统技术，细胞电融合效率较高、操作简便、对细胞无毒害、便于观察、适于仪器应用和规范操作［2，3］，因此，这种融合也被广泛应用［4］。

传统细胞电融合中的电融合槽尽管加工简便，体积较大，一次可操作毫升级样本，但电极间距较大（2～10 mm），需要几百甚至上千伏电压才足以产生103 V/cm量级的电场强度使细胞穿孔并融合［5］，这增加了信号源的制造难度与成本。而且，电融合槽中常选用平板电极［6］，电极间会形成大范围的均匀电场。这一方面不利于细胞的精确控制，导致细胞通常以长链状排队;另一方面，长链上各细胞间结合点的电场强度相同，电融合的几率也相当，从而产生大量难以后期应用的多细胞融合子。

微流控技术可以通过减小电极间间距，在低电压条件下实现强电场。这为细胞电融合技术向微型化、低电压及低功耗方向发展奠定了基础［7～9］。本文在前期研究基础上，利用COMSOL Multiphysics软件对芯片结构进行了仿真研究，特别分析了微电极阵列结构参数对电场强度与分布的影响。在此基础上获得一种优化的电极结构，并利用SoI硅片加工制作。实验研究表明:在不超过20 V的电压驱动下，芯片可以高效地实现细胞排队、电穿孔及融合。

1 芯片结构仿真与设计

微通道内的电场强度与分布对细胞电融合有重要影响，而它又直接取决于微电极的结构与排布。前期研究表明，交错式微电极阵列有利于提高电融合效率，因此，本文建立了这种结构模型（图1），并重点讨论了电极的结构参数（微电极长度l，微电极宽度w，相对微电极间间距dy，相邻微电极间间距dx）对电场强度及其分布的影响。同时，由于前期研究中在微通道转角处存在细胞堵塞问题，本文设计了直列式微通道结构，以期在这方面有所改进。

图1 交错式微电极阵列结构模型Fig 1 Interdigital microelectrodes array model

根据前期研究建立初始模型，l=20 μm，w=20 μm，dy=60 μm，dx=60μm。实验中，缓冲液电阻率为4 ×104Ω·m，电极电阻率为0.1 Ω· m。加载10 V的电信号后，得到微通道内部电场分布，如图2（b）。随后改变上述4个参数，研究对电场强度的影响。

图2 芯片模型与仿真Fig 2 Chip model and electric-field simulation

1.1 微电极长度l对电场强度的影响

仿真研究中，l从5～30 μm，以5 μm为间距变化。选取距离模型中2，3，4号微电极（图1）5 μm的位置进行采样分析，获得了电场强度分布曲线（图3（a））。随着电极长度l的增加，电场强度分布曲线的峰值也随之增加，当l增加到20μm后，峰值的增加就不再显著。而两电极之间区域的电场强度随着l的增加而降低，表明电场分布的非均匀度增加了。因此，电极长度的增加有利于提高电极间的电场强度，也有利于提高电场分布的非均匀度。但是，l的增加将增大低电场区域的面积（该区域介电电泳力较小，无法驱动细胞），将造成更多的细胞落于该区域而无法参与排队及电融合。因此，电极长度的选择需要折中。考虑到l＞20 μm后，电场的非均匀变化不显著这一特点，在设计电极时，选择l=20 μm。

1.2 微电极宽度w对电场强度的影响

微电极宽度的影响主要体现在:宽度越小，微电极高能量区域越集中，相应地最大电场强度也越大。同样位置的采样分析表明，当宽度w从10 μm增加到30 μm时，电场强度极大值从 2.03×105V/m降低到 1.74×105V/m（图3（b））。随着w的增加，其下降的速度逐渐减缓。因此，在设计微电极时可尽量减小电极宽度，进而可在较低的驱动电压下完成细胞电融合。但是，过窄的电极不利于细胞的稳定吸附。因此，实验中选择20 μm宽的电极。

1.3 相对微电极间间距dy对电场强度的影响

当相对电极间间距dy自50 μm 变化至100 μm（10 μm增量）时，不同间距条件下电场分布类似，电场强度最大值Emax随着dy的增加而减小（图3（c））。考虑到尽量在每个微电极上排列一对细胞，故在芯片设计中，应该在保证电极间距大于4个细胞直径之和的前提下，尽量减小相对电极间间距。

1.4 相邻微电极间间距dx对电场强度的影响

在电极大小固定的情况下，电极间距缩小到一定程度后，相邻电极间电场会产生相互干扰，进而对沟道内部电场分布产生影响。当相邻电极间距dx自20 μm变化至80 μm（10μm增量）时，随着dx的增大，两相邻电极间的干扰逐渐减小。采样点处的电场强度也随之增大，特别是2，3，4号微电极位置的电场强度从1.70×105V/m增加到1.92×105V/m（图3（d））。当dx≥50μm时，dx增大对于最大电场强度的增加无显著影响。结合不同dx条件下的电场分布，可以认为dx=50 μm 是一个变化阈值，只要dx≥50 μm，相邻电极间的干扰可忽略不计。

2 芯片的加工与封装

在仿真获得的直列式交错微电极阵列优化结构参数（l=20 μm，w=20 μm，dy=60 μm，dx=60 μm）基础上，利用SoI硅片［10］加工了实验芯片。

2.1 芯片材料的选择

SoI硅片的底层硅将为芯片提供有效的机械支撑;SiO2绝缘层将为顶层硅（微电极阵列）层提供良好的电绝缘特性;顶层低阻硅将用于构造微电极阵列结构，同时，微电极阵列也将形成微通道的侧壁。此外，虽然SoI硅片的底层硅经过离子注入提高了电导率（0.1 Ω/m），但为保证良好的电导性，在低阻硅上还覆盖了一层铝导电层。最后，为了保证芯片在电场及缓冲液浸泡下的可靠性与稳定性，选用SiO2在铝导电层表面形成一层保护层，提高芯片的抗氧化、抗腐蚀能力。

图3 芯片的结构参数对电场强度的影响Fig 3 Influence of the chip structure parameters on the electric-field intensity

2.2 芯片的加工

采用光刻与干法蚀刻加工芯片，具体流程为:磁控溅射在SoI硅片的顶层低阻硅表面形成一层2 μm厚的铝膜;通过光刻/腐蚀工艺刻蚀铝膜，形成一层与微电极阵列对应的铝引线层，它将大大降低微电极阵列的电阻率，避免因自身电阻带来的电压降问题，保证各微电极区域电场强度的一致性;采用PECVD工艺在铝膜表面形成一层厚度为500 nm的SiO2绝缘膜，SiO2良好的抗氧化、抗腐蚀性能，有助于保护铝引线层，提高芯片的稳定性和可靠性;通过干法刻蚀SiO2绝缘膜，形成与微电极阵列一致的SiO2绝缘层;以SiO2绝缘层为掩模，使用干法刻蚀顶层低阻硅，形成微电极阵列与微通道结构。

2.3 芯片的封装

利用金属管壳封装加工好的芯片裸片（图4（a）），微电极阵列的引线点和管壳的连接点采用φ=75 μm的金丝实现电气连接（图4（b））。实验前，用PDMS对金丝进行绝缘与保护处理。同时，制备一块与芯片大小相对应的PDMS盖片，在对应微通道进、出样口的区域打孔（φ=1 mm）用于样本液进出芯片。

图4 细胞电融合芯片Fig 4 Cell-electrofusion chip

3 细胞排队、融合实验

3.1 实验流程

将实验对象细胞离心后，利用PM缓冲液清洗3次，加入少量PM缓冲液将细胞调整到4×106/mL;随后利用微量注射器将细胞悬浮液经导管注入微通道中;加载排队信号（正弦信号，频率 1 MHz，Vp～p=3 V）;30 s后加载电压脉冲信号［11］（方波脉冲信号，脉宽为 50 μs，脉冲间隔为 1 s，V=9～15 V）;然后加载低强度的排队信号，维持细胞紧密接触以提高融合效率。

3.2 排队实验结果

当加载排队信号后，交错式齿状微电极阵列结构所形成的非均匀电场将产生一定的电场梯度。这种条件下，细胞可以看着一个电介质小球，会受到介电电泳力［12］的作用。由于PM缓冲液的离子浓度低于细胞内液离子浓度，因此，细胞将受到正向介电电泳力的作用，向高强度电场（靠近微电极）区域运动，在微电极上吸附并排列成细胞珠串。通过电压控制，大部分细胞能形成两两排队（图5）。

图5 HEK293细胞排队Fig 5 Cell alignment of the HEK293

3.3 融合实验结果

当加载低压脉冲信号后，在强电场作用下，两细胞的连接处会发生可逆性电穿孔。在持续加载的低强度排队信号作用下，介电电泳力将保持两细胞紧密接触，进而使电穿孔区域的细胞膜发生重构，建立连接通道，两细胞的胞内物质发生交换，最终形成一个完整的融合子（图6）。

图6 融合信号加载后不同时间点HEK293细胞的融合情况Fig 6 Fusion of the HEK293 at different time scales after pulses loading

4 结论

在前期研究基础上，仿真研究了微电极阵列几何参数与电场强度的关系。结果表明:微电极长度、宽度、相邻及相对电极间距非常重要。同时，设计了直列式微通道结构，避免了转角处的细胞堆积问题。利用SoI硅片加工了细胞电融合芯片，通过溅射铝引线层和增加SiO2绝缘层处理分别提高了芯片的电导性和抗氧化、抗腐蚀能力，保证了芯片内部电场分布的一致性和芯片的可靠性。实验结果表明:芯片能够以较高效率形成两两排队。借助于微电极间较短的间距，能够在低压电脉冲下形成高强度电场，并成功诱导细胞电融合。该方法融合效率较高，可以达到35%。

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