一种便携式细胞培养箱的研制*

杨 军，赵坤耀，胡 宁，谢 琳，杨 静

（1.重庆大学生物工程学院，重庆 400030;2.第三军医大学大坪医院野战外科研究所眼科，重庆 400042;3.重庆通信学院军事信息工程系，重庆 400035）

0 引言

细胞培养技术是一种用于细胞生物学和分子生物学等研究的重要方法［1］。研究细胞的功能、代谢以及细胞对环境诸因素影响的反应等需要一个既能使细胞脱离复杂环境的直接影响，又能维持正常生命活动的条件。这一条件的建立离不开培养基和细胞培养箱。细胞培养的营养环境可由培养基提供［2］，而细胞培养的环境参数则可由细胞培养箱提供。

常规的细胞培养箱能精确地提供细胞培养需要的温度、湿度、气体环境，性能稳定、响应迅速、可靠性高，且能有效防范对培养细胞的污染。但是常规的细胞培养箱尺寸、质量都较大，很难在实验细胞样本的远距离传输中派上用场。这就需要一种参数控制相对精确、体积小、质量轻的便携式细胞培养箱。这种装置还可以用于某些不经常进行细胞培养的实验室开展临时或者短期细胞实验的需要。

目前市面上的便携式细胞培养产品在温度控制上主要有水套式加热和气套式加热2种。这2种温度控制方式实现较为简单，但存在一个共同的缺点，即不能进行降温。当培养样本放置区域的温度值高于初始设定值时，温度值的下降只能依赖于自然冷却，因此，温度控制不够精确。而且，部分产品仅实现对温度的控制，而忽略了湿度参数的影响。

本文设计了一种实用性强的便携式细胞培养箱。采用半导体制冷片作为加热和降温的主要器件，利用超声换能器实现加湿，将培养箱体内温度和相对湿度值控制在设定的范围内，并得了满意的细胞培养效果。

1 仪器设计与制作

1.1 细胞培养系统的整体设计

根据便携式培养箱需要实现的功能，整个系统包括箱体和内部结构，箱体主要用于内外环境的隔离。系统原型中（图1），箱体由有机玻璃粘合而成，尺寸为300 mm×250 mm×200 mm。内部结构主要由主控模块、主要功能模块和人际交互模块3个部分组成，其中，主要功能模块实现温度和相对湿度的测量与控制。

图1 便携式细胞培养箱Fig 1 Portable cell incubator

1.2 传感器检测部分

系统中，温度和湿度的检测选用 Sensirion公司的SHT11温湿度传感器。SHT11传感器同时产生温度、相对湿度信号，经过内部电路放大，送到A/D转换器进行模数转换、校准和纠错，再通过二线串行接口将温度值和相对湿度值送至单片机PIC16F877A，最后利用单片机完成非线性补偿和温度补偿。

1.3 温度控制部分

温度控制选用半导体制冷片TEC—12706。它基于热电偶对，即把一只N型半导体和一只P型半导体连接成电偶，两端加上直流电后，在接口处就会产生温差和热量的转移。在电路上串连起若干对半导体热电偶对就构成了一个常见的制冷热电堆。借助热交换器等各种传热手段，使热电堆的热端不断散热并保持一定的温度，而把电热堆的冷端放到工作环境中去吸热降温，这就是半导体制冷的原理［3，4］。

温度控制部分将计算后得到的测量温度值与初始设定的温度值对比，再通过单片机两路输出端口电平值的变化，切换半导体制冷片的工作状态。

1.4 湿度控制部分

湿度控制部分选用超声雾化加湿器。超声雾化加湿是利用电子高频振荡（振荡频率为1.7～2.4 MHz），通过陶瓷雾化片的高频谐振，将液态水分子结构打散而产生水雾，不需加热或添加任何化学试剂［5］。

系统中设置的初始湿度值为80%RH，将通过线性补偿和温度补偿计算后得到的相对湿度值与80%RH相比，再通过单片机的一个端口输出对应高低电平，控制超声雾化加湿器工作状态的导通或截止，为系统加湿。

1.5 人机交互部分

人机交互部分的功能是初始温度值的设定与参数值的显示。针对不同温度值的需求，设置一个初始输入设置，使系统箱体以设置的温度值作为控制的目标值。显示的参数值包括设置的初始值和经过补偿计算得到的温湿度值。

2 系统软件设计

软件设计的主要任务是进行传感器测量值的修正和利用PID控制算法确定单片机脉宽调制（pulse width modulation，PWM）输出的占空比。

2.1 传感器测量值的修正

由SHT11传感器的DATA数据总线直接输出测得的相对湿度值数字量，需要进行线性补偿和温度补偿，温度值数字量需要进行修正［6］。

按照下面的等式可以计算得到相对湿度测量值SORH的线性补偿值RHlinear

其中，C1，C2，C3为线性补偿系数。测量值SORH线性补偿后的温度补偿值RHtrue为

其中，T为测试湿度值时的温度，t1和t2为温度补偿系数。由于SHT11是采用PTAY能隙材料制成的温度敏感元件，具有很好的线性输出。实际温度值可由下式算得

其中，d1和d2为特定系数，d1的取值与SHT11的工作电压有关，d2的取值则与SHT11内部A/D转换器采用的分辨率有关。

2.2 PID控制PWM占空比

本文采用增量式PID算法控制单片机PWM输出脉冲的占空比，调节半导体制冷片的工作状态，实现对温度部分的控制。PID子程序流程图如图2所示。

图2 PID子程序流程图Fig 2 Flow chart of the PID sub program

温度的控制可以分为三段:自由变温段、PID控制段、自然变温段。培养箱中培养区域由初始温度开始到80%设置温度值为自由变温段;±20%设置温度范围内为PID控制段;当温度偏差在±1℃时，为自然变温段。当温度偏差值在允许的范围内，而此时系统处于自然变温段，半导体制冷片不工作。

3 实验分析

在本设计中，细胞培养空间的大小为138 mm×200 mm×133 mm，半导体制冷片采用水冷方式散热。半导体制冷片产生的热量与超声雾化加湿器产生的湿气，通过风扇经过单孔板导入箱体中细胞培养区域［7］。

3.1 温度控制实验研究

室温28℃，当设定温度值为25℃时，箱体内细胞培养区域温度随时间的变化曲线如图3所示。

图3 温度随时间的变化曲线Fig 3 Curve of temperature change with time

培养区域的初始温度值为28.0℃ ，经过1 min，半导体制冷片已经实现将培养区的温度降至24.8℃。在随后的过程里，培养区的温度一直在25.0℃附近来回波动，偏差在±1℃以内，符合系统设计温度控制的技术指标要求。

3.2 湿度控制实验研究

测量60 min内系统箱体培养区域的相对湿度值随时间的变化如图4。

培养区域的初始相对湿度值为71%RH，5 min以内超声雾化加湿器加湿至96%RH，并且在一段时间内维持在98%RH。从第40 min左右开始，培养区内的相对湿度值开始出现微小下降，但仍然保持在90%RH以上，符合系统设计要求。

3.3 细胞培养实验研究

图4 相对湿度测量结果Fig 4 Measurement result of the relative humidity

实验采用的细胞样本为人肾上皮细胞HEK293。将一份HEK293细胞样本传代为3份，分别培养在标号为A，B，C的培养瓶。把培养瓶A，B，C分别放入常规CO2细胞培养箱、自制便携式培养箱和常温实验室中培养3 d。培养前后的细胞生长状况如图5所示。

图5 不同环境下的细胞培养结果对比Fig 5 Comparison of cells cultivation result in different environment

经过3 d不同环境的培养，CO2细胞培养箱内细胞生长情况良好，自制便携式细胞培养箱中细胞的生长的情况比CO2培养箱中稍差，常温环境中的细胞瓶中只有一些死细胞，而且存在污染。

实验结果表明:本设计的系统箱体在短期内能维持细胞的正常生长，只是由于缺乏CO2气体环境来维持pH值，细胞的长势要稍差一些。

4 结论

本文新设计制作的便携式细胞培养箱采用单片机PIC16F877A作为主控器件，将温湿度传感器、半导体致冷片、超声换能器等器件结合在一起，控制并显示箱体内的温湿度值。使用半导体致冷片作为加热和降温的主要器件，解决了部分便携式培养类产品无法实现降温的缺陷。采用雾化加湿，克服了部分产品无加湿功能的不足。与现有大多数便携类的产品相比，新的系统成本更低，更利于携带与远距离传送实验样本。

但是，设计中温度控制采用的是一般常规的控制—反馈方法，其实质是一个滞后的控制［8］，控制精度有限，今后，可考虑引入模糊控制器，以期获得更高的控制精度和更快的响应。

［1］谭玉珍.实用细胞培养技术［M］.北京:高等教育出版社，2010.

［2］Vukasinovic J，Cullen D K，LaPlaca M C，et al.A microperfused incubator for tissue mimetic 3D cultures［J］.Biomedical Microdevices，2009，11（6）:1155 －1165.

［3］庞长林，王晓浩，周兆英，等.小型半导体制冷系统的参数辨识［J］.仪器仪表学报，2003，6（24）:605 －607.

［4］邵 安，蔡纯洁，武 涛.半导体制冷温控系统的设计［J］.仪表技术，2009（11）:29－33.

［5］冯 若.超声手册［M］.南京:南京大学出版社，1999.

［6］孟 臣，李 敏，李爱传.I2C总线数字式温湿度传感器SHT11及其在单片机系统的应用［J］.国外电子元器件，2004（2）:50－54.

［7］张 辉.微纳米测量环境控制机理及系统研究［D］.合肥:合肥工业大学，2009.

［8］彭 斐.恒温培养箱的温度模糊控制［J］.机电工程，2009，26（4）:84－86.