高纯度阿扎霉素 B的分离纯化工艺研究

朱秀良，王海燕，李 宁，林 毅，张雪霞，李晓露

(微生物药物国家工程研究中心 河北省工业微生物代谢工程技术研究中心华北制药集团新药研究开发有限责任公司，河北 石家庄 050015)

阿扎霉素B是一种从链霉菌(Streptomycesmelanosporus)培养液中分离出的具有对称性的十六元环大环双内酯抗生素, 分子式C54H88O18，相对分子质量1025，为白色针状或雪花状结晶，在空气中较易失去溶剂而呈无定形粉末。在纯溶剂中溶解度小，溶于甲醇、氯仿、乙醇、乙酸乙酯，微溶于丙酮，不溶于苯、醚、水，易溶于混合溶剂。阿扎霉素B的结构式见图1。

图1 阿扎霉素B的结构式

阿扎霉素B具有大环内酯抗生素抗菌的典型特征，对枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄八叠球菌、白喉棒状杆菌、破伤风芽孢杆菌均有抑制作用[1]；具有良好的治疗线虫感染等作用，是抗寄生虫药研究热点之一；能有效提高瘤胃中丙酸产量，是一种有发展前景的牛类生长促进剂[2]；具有免疫抑制作用，可能成为强免疫抑制剂[3]。

目前，国内外关于阿扎霉素B分离纯化的报道较少,且已有的制备方法存在工艺复杂、溶媒消耗量大、所得产品纯度不高、收率低等缺点[3～5]。作者采用大孔树脂对阿扎霉素B粗粉进行分离纯化，对树脂类型、洗脱条件和上样量进行了优化。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

阿扎霉素B发酵液，华北制药集团新药公司；阿扎霉素B标准品(纯度≥98.5%)，自制；大孔树脂HZ816、HZ801，上海华震科技有限公司；大孔树脂AB-8、D312，安徽三星树脂科技有限公司；大孔树脂XAD1600，罗门哈斯公司；乙腈，色谱纯，美国Merck公司；乙醇，工业级，沧州兴隆化工有限公司；其它试剂均为国产分析纯；超纯水，自制。

高效液相色谱仪(996检测器，515泵)，Waters公司；Loborata 4000型旋转蒸发器，Heidolph公司；TGL-16G高速离心机，上海安亭科学仪器厂。

1.2 色谱条件

色谱柱：Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm,5μm)；流动相：乙腈-水(55∶45，体积比)；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：254 nm；进样量：10μL。

阿扎霉素B保留时间为11.3 min，以阿扎霉素B标准品为参照。

1.3 阿扎霉素B粗粉的制备

阿扎霉素B发酵液经真空抽滤，水顶洗，得菌丝体；然后加入4 BV工业乙醇搅拌浸泡2 h，真空抽滤，得阿扎霉素B浸提液；浸提液减压浓缩除去乙醇，以乙酸乙酯为萃取溶剂，萃取3次，合并萃取液；加入萃取液体积1%的活性炭脱色，石棉板过滤，滤液减压浓缩、结晶、干燥，得阿扎霉素B粗粉。所得粗粉产品纯度为80%左右，粗提收率大于90%。

1.4 阿扎霉素B粗粉的分离纯化

1.4.1 树脂的预处理及再生

先用乙醇充分浸泡树脂，除去致孔剂、色素和杂质，用水反复洗涤至洗涤液加乙醇后无白色浑浊；然后用2 mol·L-1的盐酸溶液搅拌浸泡4 h，水洗至中性；再用2 mol·L-1的氢氧化钠溶液搅拌浸泡4 h，水洗至中性，备用。再生方法与预处理基本相同。

1.4.2 层析树脂的选择

分别用预处理好的HZ816、HZ801、D312、AB-8和XAD1600树脂100 mL装柱，将1.0 g阿扎霉素B粗粉用乙醇-水溶解后上样于层析柱，依次用20%(体积分数，下同)、70%的乙醇洗脱，洗脱速度为2.0 mL·min-1，分管收集洗脱液，HPLC检测，将阿扎霉素B纯度大于95%的洗脱液合并，计算层析收率。

1.4.3 洗脱液浓度的选择

将1.0 g阿扎霉素B粗粉用乙醇-水溶解后上样于100 mL HZ816层析柱，先用20%的乙醇洗下极性大的杂质，再分别用60%、70%、80%的乙醇进行洗脱，洗脱速度为2.0 mL·min-1，分管收集洗脱液，HPLC检测，将阿扎霉素B纯度大于95%的洗脱液合并，计算层析收率。

1.4.4 洗脱速度的选择

将1.0 g阿扎霉素B粗粉用乙醇-水溶解后上样于100 mL HZ816层析柱，先用20%的乙醇洗下极性大的杂质，再用70%的乙醇洗脱，洗脱速度(mL·min-1)分别为1.0、1.5、2.0、2.5和3.0，分管收集洗脱液，HPLC检测，将阿扎霉素B纯度大于95%的洗脱液合并，计算层析收率。

1.4.5 上样量的选择

分别将0.5 g、0.75 g、1.0 g、1.5 g、2.0 g阿扎霉素B粗粉用乙醇-水溶解后上样于100 mLHZ816层析柱，依次用20%、70%的乙醇洗脱，洗脱速度2.0 mL·min-1，分管收集洗脱液，HPLC检测，将阿扎霉素B纯度大于95%的洗脱液合并，计算层析收率。

2 结果与讨论

2.1 层析树脂的选择

考察了5种大孔树脂对阿扎霉素B粗粉的层析分离效果，结果见表1。

表1 不同型号树脂的层析收率

由表1可知，HZ816和XAD1600两种树脂对阿扎霉素B的层析效果较好，层析收率较高，但XAD1600树脂为进口树脂，价格昂贵。因此，选定HZ816树脂为阿扎霉素B粗粉的层析树脂。

2.2 乙醇体积分数的选择(表2)

表2 乙醇体积分数对层析收率的影响

由表2可知，当用体积分数为60%的乙醇洗脱时，洗脱液体积大，洗脱不集中；而用体积分数为80%的乙醇洗脱时，洗脱虽集中，但杂质也同时被洗下，层析收率有所下降。综合洗脱效果和层析收率，选择乙醇的体积分数为70%。

2.3 洗脱速度的选择(图2)

图2 洗脱速度对层析收率的影响

由图2可知，洗脱速度过慢，洗脱不集中，层析收率偏低；而洗脱速度过快，有效组分与杂质组分得不到有效分离，层析收率也不高；洗脱速度为2.0 mL·min-1时，阿扎霉素B的层析收率最高。因此，选择洗脱速度为2.0 mL·min-1。

2.4 上样量的选择(表3)

表3 上样量对层析收率的影响

由表3可知，上样量过低，样品分散较严重，层析收率偏低；随着上样量的增加，层析收率有所上升；但上样量过多，会导致层析柱过载，造成阿扎霉素B与杂质的重叠，层析收率反而下降；当上样量为1.0 g即0.01 g·(mL树脂)-1时，HZ816树脂的层析收率最高。因此，选择上样量为0.01 g·(mL树脂)-1。

2.5 验证实验

取预处理好的HZ816树脂500 mL装柱，将5.0 g阿扎霉素B粗粉用乙醇-水溶解后上样于HZ816层析柱，依次用20%、70%的乙醇洗脱，洗脱速度为1 BV·h-1树脂床体积,分管收集洗脱液，HPLC检测，合并阿扎霉素B纯度大于95%的洗脱液，减压浓缩、萃取、结晶、干燥，得阿扎霉素B精粉，结果见表4。

由表4可知，各批次所得产品纯度均大于95%，层析收率大于72%，过程总收率大于60%。

表4 不同批次阿扎霉素B分离纯化结果(n=3)

3 结论

研究了大孔树脂层析分离阿扎霉素B的工艺过程，对树脂类型、洗脱条件和上样量进行了优化。结果表明，HZ816树脂为最佳层析介质，上样量为0.01 g·(mL树脂)-1，洗脱剂为体积分数70%的乙醇，洗脱速度为1 BV·h-1树脂床体积。按此工艺所得产品纯度大于95%，过程总收率大于60%。该方法简单易行、成本低、收率高，适宜工业化生产。

[1] 严淑玲，黄为一.阿扎霉素B(Azalomycin B)研究进展[J].微生物学通报，2002,29(5)：103-107.

[2] Chao-Miay L,Westley J.Elaiophylin as a rumen fermentation efficiency enhancer[J].Antibiotics,1993,46(2):350-352.

[3] Lee S Y,Kim H S,Kim Y H,et al.Production of elaiophylin by the strain MCY-846 in a submerged culture[J].J Microbiol Biotechnol,1997,7(4)：272-281.

[4] Alvi Ka,Peterson J,Hofmann B.Rapid identification of elaiophylin and geldanamycin inStreptomycesfermentation broths using CPC coupled with a photodiode array detector and LC-MS methodologies[J].J Ind Microbiol,1995,12(2)：80-84.

[5] 江曙，黄为一.阿扎霉素B提取纯化工艺的优化[J].生物技术，2008，18(4)：74-76.