Wip1对肿瘤发生及免疫系统的调节作用①

史建峰 胡雪莲 刘光伟 赵 勇

(中国科学院动物研究所生物膜与膜生物工程国家重点实验室移植生物学研究组，北京100101)

1 Wip1基因和蛋白结构

Wip1(Wild type p53-induced phosphatase 1)是于1997年由Fiscella等在寻找γ射线照射下p53基因的靶基因时发现，为一种依赖于p53高表达的原癌基因。Wip1属于丝氨酸/苏氨酸磷酸酶，主要定位于胞核内，由PPM1D(Protein phosphatase magnesium-dependent 1 delta)基因编码。PPM1D位于人染色体17q23/q24区域，在小鼠中位于11号染色体与p53基因邻近，共有6个编码区。小鼠与人PPM1D基因有83%的同源性。人Wip1有605个氨基酸，分子量61 kD，小鼠Wip1包括598个氨基酸，分子量为66 kD。人Wip1序列可分为两个主要区域，N端第1～375位氨基酸为高度保守的磷酸酶区，第376～605位氨基酸为低保守无催化区，第65～368位氨基酸与PP2C蛋白酶家族有高度同源性，其中N端有3个区域完全相同，第100～108位氨基酸是PP2C蛋白酶家族的标签，且Wip1激活依赖于二价阳离子和对冈田酸的不敏感，使之区别于PP1(Protein phosphatase type 1)、PP2A(Protein phosphatase type 2A)和PP2B(Protein phosphatase type 2B)家族磷酸蛋白酶，因此将Wip1归属于PP2C(Protein phosphatase type 2C)蛋 白酶 家族［1，2］。PPM1D 的mRNA在成年鼠和胚胎鼠的各种器官中均有表达，在雄鼠睾丸中表达水平最高［3］。

2 Wip1与DNA修复和肿瘤发生

对Wip1的研究主要集中于其对DNA修复及肿瘤发生的调控。2000年，小鼠PPM1D基因被克隆并测序，证实其在p53诱导细胞凋亡通路中发挥极其重要的负调节作用。它使p53蛋白去磷酸化而失活，导致其诱导细胞凋亡的通路中断，从而实现其抗凋亡功能［2］。Wip1对p53的调控作用具有多样性而且参与许多重要生命活动调节。外界环境压力(如离子辐射、紫外光、化学试剂等)引起DNA损伤，机体存在一套精密的调节机制使DNA自我修复或者促进病变细胞发生凋亡。研究表明，Wip1蛋白可以对机体的DNA损伤修复产生负调控作用，Wip1蛋白表达依赖于p53蛋白［1，4］。Wip1可以通过负调控 p38、p53、ATM(Ataxia-telangiectasia mutated)、Chk1/Chk2等激酶来影响真核细胞DNA损伤修复功能:p38基因是第一个被确定的PPM1D靶基因，在紫外线或γ射线照射下，p38蛋白Thr180和Tyr182位点迅速发生磷酸化，p38蛋白激活后进一步磷酸化其下游 p53 蛋白 Ser15、Ser33、Ser46和 Ser392位点，从而激活p53蛋白导致细胞周期阻滞或细胞凋亡［5，6］。而Wip1是p38-MAPK(p38 mitogen-activated protein kinase)/p53途径中的负反馈调节因子，Wip1蛋白既可以通过去磷酸化p38蛋白(Thr180)蛋白激酶抑制p38通路下游分子p53蛋白的活性，也可以通过直接使p53蛋白(Ser15)去磷酸化而抑制其活性并终止其信号通路(图 1)［4］。

ATM具有调控DNA修复和细胞周期关卡、维持染色体稳定等生物功能。DNA损伤导致PIKK(Phosphatidylinositol 3-kinase-like protein kinases)激酶诱导ATM/ATR(Ataxia-telangiectasia and Rad3-related)等活化，ATR激酶使Chk1蛋白Ser317和Ser345位点发生磷酸化而被激活。ATM磷酸化引起Chk2的Ser516和Thr387发生自身磷酸化，使Chk2获得激酶活性。Chk1和Chk2使下游p53蛋白和Cdc25(Cell division cyclin 25)家族成员和其他底物发生磷酸化，将损伤信号传递至下游，引发细胞周期阻滞及DNA损伤修复等生物学效应［7-10］，ATM还可以磷酸化MDM2(Murine double minute-2)Ser395位点，MDM2 是E3泛素连接酶，作为p53蛋白的抑制子MDM2与p53蛋白结合，促进p53蛋白泛素化修饰和降解及其出核移位过程，从而抑制p53蛋白的转录活性。同时p53蛋白也控制MDM2蛋白表达水平以保证细胞正常生命周期［11］。DNA损伤因素诱导p53蛋白/MDM2磷酸化修饰，ATM磷酸化MDM2的Ser395位点，其酸性保守区域Ⅱ(氨基酸237～260)高度磷酸化，从而抑制p53/MDM2复合体的形成，减弱MDM2对p53的降解作用［12，13］。Wip1 可以负调节 ATM(Ser1981)、MDM2(Ser395)、Chk2(Thr68)的磷酸化从而抑制ATM和p53功能(图1)。研究表明Wip1缺失导致ATM激酶的激活，过表达则明显减少ATM的激活［14］。

Wip1负调控DNA损伤修复从而抑制细胞凋亡，使机体易于发生肿瘤，因此，Wip1表现出原癌基因特性。但是Wip1的致癌机制目前还未完全阐述清楚。Wip1在人乳腺癌、恶性脑瘤、卵巢癌中高表达［1，6，15-18］。研究表明，肿瘤发生时常会伴随 p53 蛋白编码基因TP53的突变，而Wip1过表达的乳腺癌病例中却很少发现 TP53 基因发生突变［6，19，20］，有人推测Wip1并不是诱发TP53基因突变引起肿瘤，而是通过抑制p53蛋白的功能促进肿瘤发生。Wip1不仅可以通过调节ATM、MDM2、Chk1、Chk2和 p38MAPK间接负调控p53蛋白，还可以直接作用于p53使其N端(Ser15)去磷酸化导致失活［5］。但是，这些通路在肿瘤发生中的作用需要更多的癌症模型佐证。

3 Wip1对免疫系统的调控作用

图1 Wip1调控p53的信号途径简图Fig.1 The Wip1-p53 regulating pathway

Wip1基因的表达受一些非p53依赖的因子调控，如CREB(cAMP-response element binding protein)和 NF-κB［21-23］。NF-κB 在细胞炎症反应中发挥重要作用，它可以激活WIP1基因的表达。Wip1基因有一段保守的κB结合位点，并且上调和抑制NF-κB的功能分别导致Wip1表达升高和降低。研究证实，NF-κB的p65亚基可以直接结合到Wip1基因上游启动子从而调控其生物学活性［22］;反之 Wip1对NF-κB具有负调控作用，通过基因组水平的siRNA筛选发现抑制Wip1可以使NF-κB的活化能力增强。Wip1-/-小鼠 Hela细胞中 NF-κB目标基因如TNF-α的mRNA表达升高，Wip1-/-小鼠脾细胞分泌NF-κB 依赖的炎症因子上调，CD80+、MHCⅡ+和CD40+脾细胞比率也有相应的升高，而Wip1过表达的小鼠Hela细胞中TNF-α等NF-κB依赖的细胞因子分泌量明显降低［3］。研究表明，Wip1对NF-κB的调控发生在其与DNA结合的上游。Wip1通过使NF-κB的P65(Ser536)去磷酸化使 NF-κB不能招募共转录因子p300，导致其不能有效激活下游通路。Wip1也可以通过负调节p38来抑制NF-κB功能，使NF-κB 依赖的炎症因子如 IL-1、6、8 表达量降低［24］。此外，研究发现，Wip1-/-小鼠脾脏、淋巴结和骨髓都会发生不同程度的肿大并伴随巨噬细胞和粒细胞增多，5%Wip1-/-小鼠发生皮肤溃疡，Wip1-/-的小鼠在外界抗原刺激表现出免疫缺陷更容易受到感染。以上结果提示，Wip1具有抑制炎症反应的作用［3，24］。Wip1对NF-κB具有负调作用，肿瘤发生会促进炎症反应，NF-κB作为一个炎症反应的重要调节因子，在调控肿瘤发生中也发挥了作用，但目前NF-κB对肿瘤发生的正负调控还存在争议，所以Wip1是否可以通过调节NF-κB的功能间接调控肿瘤发生还有待更深层的研究。

Wip1对淋巴免疫细胞发育和功能具有调节功能，Wip1-/-幼年小鼠胸腺变小，胸腺髓质区相对于正常小鼠显著变小，TCR-β+的胸腺细胞数量显著降低，TCR-γδ+细胞数却不受影响。Wip1-/-小鼠SP期(CD4+或CD8+)和DP期(CD4+CD8+)细胞比率正常，但是细胞数目下降。DN期(CD4-CD8-)细胞数目正常，但是细胞比率增加。说明Wip1-/-小鼠胸腺细胞从DN期到SP期发育过程中存在缺陷。进一步研究发现，Wip1-/-小鼠DN3(CD44-CD25+)期细胞比率升高而DN4(CD44-CD25-)期比率和数量都发生下降，这是因为Wip1 mRNA在DN3期向DN4期发育过程中表达升高，Wip1-/-小鼠胸腺细胞失去对p53蛋白活性负调功能，导致胸腺细胞由DN3期向DN4期发育时p53蛋白表达上调至使细胞周期阻滞，使更多的细胞处于S/G2/M期，从而引起Wip1-/-小鼠DN4期、DP期和SP期细胞数目减少［25］。

Wip1-/-小鼠外周免疫器官也有组织病理学表征，如脾脏白髓缩小、白髓与红髓界限不清，并伴随其他细胞浸润。Wip1-/-小鼠脾脏T、B细胞数目相对于正常鼠没有改变，但是CD4+细胞数增加，CD8+细胞数减少。T细胞和B细胞在外界抗原和丝裂原刺激后，表现出的增殖能力相比正常小鼠显著下降［26］。Wip1可以影响淋巴细胞的发育分化及其功能，Wip1在免疫监视和机体稳态平衡调解中可能发挥功能，对免疫细胞杀伤癌变细胞保持机体稳态具有一定的调节作用。

4 结束语

虽然Wip1早在1997年就已发现，其在肿瘤发生、免疫系统发育等方面发挥重要调节作用。但目前我们对Wip1的研究仍不够全面。在肿瘤和免疫疾病模型中Wip1调控分子机制有待探究。Wip1对免疫器官的发育及免疫细胞各亚群的增殖、分化和细胞因子分泌的调节机制仍需要深入研究。

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