黄芪多糖对实验性糖尿病大鼠心肌损伤的保护作用

王凤杰，刘锦红，王丽芳，陈显兵

湖北民族学院医学院(湖北恩施445000)

糖尿病并发心功能障碍是2型糖尿病患者的主要死亡原因之一，其中可独立存在的糖尿病心肌病正受到越来越多的关注，而在糖尿病早期可出现心肌细胞肥大、凋亡和坏死，随着病情发展，逐渐出现细胞外基质堆积，心肌间质重构、纤维化［1］。也有研究证实糖尿病心肌病(DCM)是心肌对糖尿病的急性反应而导致的慢性病理改变，这些急性反应包括基因表达异常、信号转导改变及细胞凋亡［2］。因此我们通过观察DM早期心肌损伤及细胞凋亡情况，探讨其可能的发生机制。黄芪多糖是从传统中药黄芪中提取出来的一种有较强生物活性的大分子化合物，我们前期研究［3，5，6］均已证明 APS 能改善糖尿病的物质代谢和慢性并发症。本文旨在探讨APS对于实验性糖尿病大鼠心肌的保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 参照文献［7］，SPF级雄性SD大鼠40只，随机选取16只分为正常组(C，n=8)和APS对照组(CA，n=8)，喂食普通饲料。其余大鼠喂食高脂饲料，造模成功后选取16只分为糖尿病组(DM，n=8)和APS治疗组(DA，n=8)，其中 CA 组和DA组分别给予APS(700 mg/kg·d－1)灌胃治疗，对照组给予等体积生理盐水灌胃，持续8周。

1.2 试剂与仪器 膜荚黄芪(Astragalus membranaceus)，上海药材公司，由湖北中医药大学药用植物鉴定教研室鉴定;One Touch Ultra快速血糖仪(美国强生);Anti J－20XP高速冷冻离心机(美国Beckman公司);STZ购自sigma公司;Triage免疫荧光定量meter plusc BNP、cTnI测试条购自美国博适公司，按试剂盒说明书进行检测。

1.3 观察指标及其检测与方法

(1)观察指标:观察各组大鼠一般情况;于第8周末、11周末、14周末、17周末清晨同一时间称取各组大鼠体重，并记录。第17周末各组大鼠禁食12 h，常规摘眼球取血，用血糖仪测定FBG后，4℃下3000 r/min离心10min，取血清于－80℃冰箱保存待用。颈椎脱臼处死大鼠后迅速摘取其心脏，4℃生理盐水冲洗，滤纸吸干称重，按心重/体重计算心脏指数(mg/g)，取左心室肌组织置于体积分数为10%中性甲醛中固定24 h后，进行常规石蜡包埋切片，余下部分－80℃冰箱保存待用;免疫荧光定量检测外周血B型脑钠肽(BNP)、心肌肌钙蛋白I(cTnI)的水平;HOMA－IR是用于评价个体的胰岛素抵抗水平的指标，计算方法是IRI=空腹血糖水平(FBG，mmol/L) ×空腹胰岛素水平(FINS，mIU/L)/22.5。

(2)心肌细胞凋亡指数(AI)的测定:用 TUNEL法测定心肌细胞凋亡情况，在光镜下观察，以细胞核呈棕黄色为凋亡阳性细胞。随机计数无重叠具有代表性的5个400倍视野，以平均每100个细胞核中含凋亡细胞个数作为 AI［4］。

1.4 统计学处理 所有数据均采用均数±标准差表示，并采用SPSS17.0统计软件处理，行t检验和相关分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验动物体重变化 DM组、DA组大鼠体重在第8周末(治疗前)即显著低于同龄C组，差异有统计学意义(P＜0.05);分组给药治疗后，DM组大鼠体重进一步减轻，14周及17周末DM大鼠体重较C组明显降低(P＜0.05)。而DA组随着治疗时间延长，大鼠体重减轻逐渐得到控制，至17周末，DA组大鼠体重明显高于DM组(P＜0.05)。CA组和C组体重变化同步，随年龄增长体重逐渐增加，幅度处于正常生理变化范围，CA组治疗前后体重与同龄C组比较差异无统计学意义，见表1。

表1 实验大鼠体重变化情况(g)

2.2 实验动物心脏体重指数、血BNP、cTnI水平治疗8周末处死动物，取出心脏，肉眼可见DM组大鼠心脏体积增大，左心室壁增厚;而治疗后DA组大鼠心脏体积增大不明显。结果显示DM组大鼠较C组心脏体重指数明显增加，cTnI、BNP水平降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。

表2 实验动物心脏体重指数、cTnI、血BNP水平比较(n=8)

2.3 FBG、血FFA、IRI水平 至第17周末(治疗第8周末)，DM组三项指标水平与C组比较均显著升高(P＜0.01)，而 DA组 IRI、FBG、FFA水平与 DM组比较均显著降低，差异均有统计学意义(P＜0.01);C组与CA组IRI、FBG、FFA差异没有统计学意义。(见表3)。

表3 第17周末各组大鼠血FFA、FBG、IRI的比较

2.4 心肌组织形态学观察 HE染色结果显示，C组与CA组大鼠心肌纤维排列整齐，心肌细胞形态正常，细胞界限清晰，间质及微血管正常。DM组心肌细胞肥大凋亡，部分核出现丢失现象，肌纤维排列紊乱、断裂，间质内可见广泛纤维组织、脂肪组织增生，及慢性炎细胞浸润;亦可见明显扩张肥厚血管;DA组细胞损伤及间质纤维化现象明显改善。见图1。

图1 心室肌组织HE染色(400X)

2.5 心肌细胞凋亡指数 正常心肌细胞核复染后呈蓝色，细胞核卵圆形，位于细胞中央，大小较一致;凋亡细胞核呈棕色或棕褐色，细胞核大小不一，甚至出现核丢失现象。TUNEL法对心肌细胞凋亡进行测定显示，DM组心肌凋亡指数(58.04±12.69)与C组(1.22±0.59)相比显著升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。但DA组大鼠心肌细胞凋亡指数(21.23±9.68)与DM组比较明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.6 血浆BNP与心肌细胞AI相关性分析 各组大鼠血浆BNP与AI呈显著正相关，均为P＜0.01，见表4。

表4 血浆BNP与心肌细胞AI相关性分析

3 讨论

本研究通过给SD大鼠高脂饲料喂养并注射小剂量STZ，成功复制出2型糖尿病动物模型，而且前期大量实验已经研究证明了APS能降低2型糖尿病大鼠的血糖和血脂，改善糖耐量异常，减少肝脏脂肪沉积和减轻体重，增加机体的胰岛素敏感性等［5，6］，增强能量感受器 AMPK 的活性，进而改善2型糖尿病大鼠心肌能量代谢异常［7］。近年来研究发现，DM患者脂质代谢异常，IFFA积聚，心肌钙处理能力下降，心肌结构和功能异常［8］，DCM的发病还与心肌细胞凋亡等有关［9］，主要病理改变是心肌细胞肥大、凋亡、心肌纤维化和心肌微小血管广泛内膜病变［12］。这些病理性改变就是心脏扩大和心脏重量指数增加的原因，是心肌组织对糖尿病的早期综合性反应，并且是DCM晚期并发心功能不全的根本原因。

血清cTnI是心肌特有的调节蛋白，当心肌损伤后cTnI很快被释放到血液中，它是临床用于诊断早期心肌损伤及心肌梗死的理想生化指标。B型尿钠肽又称脑尿钠肽(Brain natriuretic peptide，BNP)，是由心肌细胞合成的具有生物学活性的天然激素，主要在心室表达。当左心室功能不全时，由于心肌扩张而快速合成释放入血，有助于调节心脏功能。BNP作为心衰定量标志物，不仅反映左室收缩功能障碍，也反映左室舒张功能障碍、瓣膜功能障碍和右室功能障碍情况，有学者通过测定血浆ANP浓度可作为糖尿病引起心肌损害的指标［10］，我们综合考虑认为BNP更能反映糖尿病心肌损伤，因此测定结果显示DM组大鼠血清cTnI浓度、BNP均明显高于正常组，且治疗后DA组cTnI、BNP下降，说明APS对于糖尿病早期心肌损伤有一定的疗效。

糖尿病胰岛素抵抗时，糖利用障碍、脂质氧化增强及蛋白质合成降低，心肌细胞能量代谢异常，钠、钙泵功能下降，心肌兴奋—收缩及复极—舒张脱偶联;脂质氧化增强，产生大量中间产物和自由基、高糖血症、脂质沉积诱导心肌细胞凋亡及间质纤维化。有研究证实柚皮苷可明显改善胰岛素抵抗，改善DCM 的 OGTT、FFA 和 GSP［11］，也可能通过上调心肌组织中HIF－1α作用调节糖脂代谢、改善微循环等减轻了DCM大鼠心肌病变［12］，我们实验显示APS可明显降低DM大鼠胰岛素抵抗，改善血FFA、FBG水平，这与文献报道一致。韦金儒等研究证实缬沙坦可以抑制心肌组织中3－硝基酪氨酸(3－NT)诱导的心肌细胞凋亡，但对心脏扩大无明显改善，认为心肌细胞凋亡不是DCM大鼠心脏扩大的唯一发病机制［13］，因此得出3－NT增多是心肌细胞凋亡的重要原因，氧化应激是细胞凋亡、心肌细胞坏死和纤维化重要途径。我们的研究结果表明黄芪多糖对心肌病损有明显改善作用，同时降低糖尿病大鼠血糖及血脂作用，减轻心肌损伤，保护心脏。DM组大鼠血糖及心脏指数较C组明显升高，而APS治疗后明显降低心脏指数及血糖，提示APS能抑制大鼠心肌肥厚。HE染色发现DM组大鼠心肌纤维排列紊乱，出现核丢失现象，心肌间质纤维化，且心肌细胞凋亡率较正常组明显升高，而APS治疗后DA组大鼠心肌纤维紊乱有明显改善，凋亡指数亦显著下降，提示APS可以通过改善大鼠心肌纤维紊乱，降低糖尿病大鼠心肌细胞凋亡率，对大鼠心肌组织起到保护作用。且DM大鼠血BNP表达增多与心肌细胞凋亡呈现密切正相关，证明APS能够抑制心室重构，减少心肌肥厚、坏死，降低室壁张力，从而降低BNP的分泌，减少心肌细胞凋亡，发挥心血管保护的效应，改善心肌功能。

综上所述，APS可有效改善实验性DM大鼠心肌纤维紊乱、降低心肌细胞的凋亡，从而保护DM大鼠心肌组织损伤，延缓DM心脏并发症进展，可能与其改善DM大鼠胰岛素抵抗、阻断FFA活化、抑制BNP的表达有关，其机制有待进一步研究。

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