延胡索乙素对老年大鼠红细胞膜影响的实验研究

马伯艳，袁良杰，牛雯颖，肖洪彬

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

延胡索乙素(dl－tetrahydropalmatine，dl－THP)为罂粟科紫堇属植物延胡索(Corydalisyanhusuo W.T.Wang)中主要成分。本课题组研究已表明，dl－THP对老龄大鼠红细胞聚集性增高有很好的改善作用，同时对红细胞变形性也有一定影响。因此，我们拟进一步从红细胞膜成分变化角度就dl－THP改善血液流变学机制进行研究。

1 材料

1.1 动物

清洁级健康Wistar老龄大鼠40只，清洁级健康Wistar青年大鼠10只，均由黑龙江中医药大学提供(合格证号SCXK(黑)2008004)，室温20～22℃，自由饮水，饲固体饲料。

1.2 药物

罗痛定片(主要成分为延胡索乙素，四川金药师制药有限公司，批号091101);阿司匹林片(黑龙江百泰药业有限公司，批号100101)。

1.3 试剂

PBS(pH=7.4，NaCl 6g，KCl 0.2g，KH2PO40.2g和 Na2HPO41.56g，溶于800 ml蒸馏水，1mol/L HCl调节溶液 pH值至7.4，蒸馏水定容至1L，4℃冰箱保存);Tris－HCl(pH=7.4，0.605g Tris溶于800ml蒸馏水中，1mol/L HCl调 pH值，补至终体积1L，4℃冰箱保存);1%抗凝剂;2ml肝素钠注射液(每瓶 2ml，12500U)加10.5ml生理盐水而成;1mmol/mL PMSF(0.0174g PMSF用异丙醇溶解，定容于10ml，现用现配);20%乌拉坦(20g氨基甲酸乙酯用生理盐水溶解，定容至100ml即可，密封常温保存)。

总胆固醇试剂盒(中生北控生物科技股份有限公司);唾液酸试剂盒、巯基试剂盒、SOD试剂盒、MDA试剂盒、ATP酶试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.4 仪器

KQ－800KDE型高功率数控超声仪(昆山市超声仪器有限公司);722分光光度计(山东高密分析仪器厂);BECKMAN超速离心机(美国贝克曼库尔特有限公司);TGL－16G型高速台式离心机(上海医用分析仪器厂);分析天平(梅特勒托利多仪器(上海)有限公司);Waters 2695高效液相色谱仪(美国Waters公司);ELSD 2000型蒸发光散射检测器(美国Alltech公司)。

2 方法

2.1 动物分组及给药

25～36月龄Wistar大鼠40只，雌雄各半，体质量(320±46)g，按体重随机分为延胡索乙素高(延高)、低剂量组(延低)、老龄空白组(老龄空白)、阿司匹林组，每组10只;另取3～4月龄Wistar青年大鼠10只，雌雄各半，体质量(108±19)g，作为青年空白组(青龄空白)。延胡索乙素高剂量组按132.8mg/kg浓度灌胃给药、低剂量组按33.2mg/kg浓度灌胃给药，阿司匹林组按13.83mg/kg浓度灌胃给药，各组按10ml/kg体积灌胃，每日1次，连续给药14天。

2.2 取血及红细胞膜制备

取血前禁食24h，不禁水，末次给药1h后，大鼠腹腔注射20%乌拉坦5ml/kg麻醉，分离右侧颈总动脉，采血测定各项指标及制备红细胞膜。

取新鲜肝素抗凝血 5ml，以 3 000r/min离心10min，弃上清，除去中间层(主要为白细胞和血小板)，以1∶3比例加入等渗pH 7.4 PBS，3 000r/min离心10min，弃上清，反复洗涤3次，得到红细胞悬液。向红细胞悬液中以1∶80比例加入预冷5mmol/L pH 7.4 Tris－HCl溶液，同时加入苯甲基磺酰氟(PMSF)0.1mmol/L，以80Hz 20℃超声15min，放入4℃溶血过夜，将所得红细胞溶血液以15 000r/min离心10min，弃上清，再加入 5mmol/L pH 7.4 Tris－HCl溶液，以15 000r/min离心10min，反复洗涤3次至乳白色膜，将其1∶1悬浮在PBS溶液中。

2.3 Na+－K+－ATP酶活性及胆固醇含量测定

Na+－K+－ATP酶活性采用比色法，按照试剂盒操作测定。红细胞膜胆固醇含量测定采用高效液相色谱法。

2.4 唾液酸含量及巯基含量测定 唾液酸含量测定采用5－甲基苯二酚络合法检测;巯基含量测定采用比色法，按照试剂盒说明书规定操作。

2.5 红细胞膜SOD活力及MDA含量测定 SOD活力测定采用黄嘌呤氧化酶法检测;MDA含量测定采用TBA(硫代巴比妥酸)法。按照试剂盒说明书进行。

2.6 统计学处理

3 结果

3.1 红细胞膜胆固醇含量及Na+－K+－ATP酶活性的影响 结果见表1。

表1 延胡索乙素对红细胞膜胆固醇含量及Na+－K+－ATP酶活性的影响(s，n=10)

表1 延胡索乙素对红细胞膜胆固醇含量及Na+－K+－ATP酶活性的影响(s，n=10)

注:与老龄空白组比较，*P﹤0.05，＊＊P﹤0.01。

组别 剂量(mg/kg)Na+－K+－ATP酶(μmolPi/mgprot/hour)胆固醇含量(mmol/mg膜蛋白)老龄空白 － 1.402 ±0.134 1.098 ±0.231青龄空白 － 2.076±0.222＊＊ 0.913±0.087*延高 132.8 1.653 ±0.127* 0.846 ±0.142＊＊延低 33.2 1.629 ±0.323 0.800 ±0.283＊＊阿司匹林13.83 1.505 ±0.350 1.053 ±0.187

由表1可见，延胡索乙素高剂量组可增加老年大鼠红细胞膜Na+－K+－ATP酶活性(P＜0.05)，延胡索乙素两个剂量组均可明显降低老龄大鼠红细胞膜胆固醇含量(P＜0.01)。

3.2 老龄鼠红细胞膜唾液酸及巯基含量的影响 结果见表2。由表2可见，与老龄空白对照组比较，延胡索乙素高剂量组能够明显增加老龄大鼠红细胞膜巯基含量(P＜0.05)，唾液酸含量有升高趋势，但与老龄空白组比较无统计学意义。

表2 延胡索乙素对老龄鼠红细胞膜唾液酸及巯基含量的影响(s，n=10)

表2 延胡索乙素对老龄鼠红细胞膜唾液酸及巯基含量的影响(s，n=10)

注:与老龄空白组比较，*P﹤0.05，＊＊P﹤0.01。

组别 剂量(mg/kg)唾液酸(mmol/gprot)巯基(mmol/gprot)老龄空白 － 0.446 ±0.110 0.264 ±0.033青龄空白 － 0.538±0.075＊＊ 0.355±0.030＊＊延高 132.8 0.495 ±0.110 0.327 ±0.033＊＊延低 33.2 0.483 ±0.084 0.276 ±0.074阿司匹林13.83 0.470 ±0.105 0.292 ±0.449

3.3 老龄大鼠红细胞膜SOD及MDA的影响 结果见表3。

表3 延胡索乙素对老龄大鼠红细胞膜SOD及MDA的影响(s，n=10)

表3 延胡索乙素对老龄大鼠红细胞膜SOD及MDA的影响(s，n=10)

注:与老龄空白组比较，*P﹤0.05，＊＊P﹤0.01。

组别 剂量(mg/kg)SOD(U/mgprot)MDA(nmol/mgprot)老龄空白3.68 ±0.55 4.48 ±0.61青龄空白 － 6.09±0.34＊＊ 3.58±0.43＊＊延高 132.8 4.54 ±0.99* 3.8 ±0.4*延低 33.2 4.21 ±1.11 4.15 ±0.31阿司匹林 13.83 4.44 ±0.71 3.80 ±0.57－＊＊

由表3可见，与老龄空白对照组比较，延胡索乙素高剂量组可提高SOD活力(P＜0.05)，降低MDA水平(P＜0.05)。

4 讨论

临床上或动物实验时测量全血黏度常采用低切变率和高切变率进行测定，而低切变率的全血粘度主要反映红细胞的聚集程度，高切变率的全血粘度主要反映红细胞的变形性。我们前期研究显示，延胡索乙素高剂量组可明显降低老年大鼠低切变率下全血黏度，对高切变率全血黏度有降低趋势，同时可提高红细胞变形能力趋势。红细胞具有变形性和聚集性与红细胞膜的流变学特征，即红细胞膜结构、膜的组成成分、膜的流动性等方面密切相关。胆固醇是红细胞膜脂质主要成分，其功能是提高细胞膜双分子层机械稳定性、调节膜流动性及通透性、维持细胞正常代谢及形态相对稳定。红细胞自身不能合成胆固醇等脂质，而是与血浆胆固醇快速实行交换，因此当由于年龄增长而使血浆胆固醇含量升高，红细胞膜胆固醇浓度也升高，继而引起膜胆固醇及胆固醇/磷脂比值升高，蛋白质跨膜运动及磷脂侧向运动均受到限制，膜的刚性和脆性增高，膜变形能力下降。ATP酶广泛存在细胞质膜上，维持胞内外渗透压平衡和跨膜电化学梯度，确保胞内外离子浓度相对稳定。本实验研究结果显示，老年大鼠与青年大鼠比较，其红细胞膜胆固醇增加、Na+－K+－ATP酶活性降低、唾液酸含量及巯基含量明显减少、MDA增加而SOD减少，说明老年大鼠上述红细胞膜微观指标变化是其宏观血液流变学变化的部分原因。而延胡索乙素(尤其是延胡索乙素高剂量组)可以增强老年大鼠红细胞膜Na+－K+－ATP酶活性、减少红细胞膜胆固醇含量和巯基含量、减少MDA并增加SOD活性。说明延胡索乙素改善老年大鼠血液流变学异常的机制可能与上述指标变化相关。