中药生半夏水煎液的毒性研究

严晓莺，陈巨鹏，董菊，徐德国，赵凤鸣，王明艳

(1.南京中医药大学，江苏 南京 210046，2.江苏省中医院，江苏 南京 210029)

《中国药典》记载半夏为天南星科植物半夏的干燥块茎;辛、温;有毒;需炮制后使用。很多医者认为［1］生半夏治疗恶性肿瘤临床效果较好，而且经过水煎，毒性降低，服用时较为安全。南京中医药大学张民庆教授应用含有生半夏的涤痰化瘀方治疗食道癌取得较好疗效，且得到体内和体外实验［2－3］的证实。然而，生半夏在发挥治疗作用的同时，对机体有无损伤，颇存争议。本实验利用骨髓微核技术和精子畸形技术对生半夏水煎液遗传毒性进行评价，病理组织切片、HE染色对生半夏水煎液肝肾毒性进行评价，探讨生半夏水煎液的遗传毒性与肝肾毒性。

1 实验材料

1.1 动物

ICR小鼠共25只，体质量18～22g，购自上海斯莱克公司，合格证编号:2007000510241;饲养观察3天后用于试验。试验动物的饲养环境温度控制在18～25℃。自由采食、饮水，熟悉环境5日。

1.2 药物

生半夏由南京中医药大学药学院提供。注射用环磷酰胺(CP，江苏省恒瑞医药股份有限公司，批号10051921)。

1.3 试剂

小牛血清;乙醇(分析纯);甲醇(分析纯);吉姆萨(Giemsa)染料;2%伊红染液;氯化钠注射液;蒸馏水。

1.4 仪器与器材

离心机(LXJ－64－01型离心机，北京);显微镜(Olympus光学显微镜，日本);旋转蒸发仪;吸管;1mL注射器;灌胃针;眼科剪;小平皿;滤纸;玻片;镊子;血管钳;漏斗。

2 实验方法

2.1 生半夏水煎液的制备

取100g生半夏，加蒸馏水200mL浸泡30min后煎煮，水沸后小火煎煮30min，滤出药液;再加蒸馏水100mL煎煮30min，合并两次滤液，浓缩为50mL，终浓度为2g/mL生药。4℃冰箱保存待用，实验前以生理盐水将药液稀释成所需的浓度。

2.2 实验分组

将25只小鼠随机分为5组，即阴性对照组、阳性对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，每组各5只。阴性对照组小鼠给予氯化钠注射液0.25mL/20g/d灌胃给药，连续10天;阳性对照组小鼠给予环磷酰胺40mg/kg处死前24h腹腔注射;低、中、高3个剂量组小鼠分别予1g/kg、5g/kg、25g/kg(根据成人临床常用剂量换算，取其用量的4倍、20倍、100倍)的药液灌胃，每24h 1次，连续10日。

2.3 小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验

给药后第11天，颈椎脱臼法处死小鼠，剪取一侧股骨，除去血污肌肉，剪掉股骨头，用止血钳挤出骨髓液，与玻片一端的小牛血清混匀，常规涂片，待自然干燥后，以甲醇固定5～10min，再以Giemsa染液染色15min，蒸馏水冲洗、晾干。

镜检:油镜下按一定顺序进行嗜多染红细胞(PCE)微核计数。每只动物计数1 000个PCE，观察含有微核PCE数，以千分率表示微核率。

2.4 小鼠精子畸形试验

分离小鼠双侧附睾，放入盛有2mL生理盐水注射液的小试管中，纵向剪开附睾1～2刀，轻轻摇动3～5min，双层滤纸过滤，吸取滤液涂片，空气晾干。甲醇固定5～10min，2%伊红染色1h，蒸馏水冲洗，晾干。

镜检:高倍镜按顺序检查精子形态，每只动物检查完整精子1 000个。并计数无钩、香蕉头、无定形、胖头、双头、双尾及尾折叠的畸形精子数，计算每组动物精子畸形百分率。

2.5 病理组织形态学检测

取小鼠的肝脏、肾脏，计算肝脏指数(肝脏质量/体质量)和肾脏指数(肝脏质量/体质量);肝脏、肾脏4%甲醛固定后，送江苏省中医院病理科检测。

2.6 统计学处理

实验数据，采用统计软件SPSS 15.0进行单因素方差分析。

3 实验结果

3.1 小鼠骨髓嗜多染红细胞微核实验结果

生半夏水煎液低、中剂量组诱发的微核频率与阴性对照组相比，均无显著性差异(P＞0.05);高剂量组诱发的微核与阴性对照组相比，有显著差异(P＜0.05)，结果见表1，表明生半夏水煎液以25g/kg的剂量连续灌胃10天，能引起骨髓嗜多染红细胞微核率的升高。

表1 生半夏水煎液对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率影响(s)

表1 生半夏水煎液对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率影响(s)

注:与阴性组比较，*P ＜0.05。

组别 给药剂量 观察PCE数 微核总数 微核率(‰)阴性组(NS)0.25mL/只/d 5 000 3 0.6 ±0.89阳性组(CP)40mg/kg/d 5 000 91 18.2 ±3.42*生半夏低剂量组 1g/kg/d 5 000 6 1.2 ±1.30生半夏中剂量组 5g/kg/d 5 000 8 1.6 ±0.89生半夏高剂量组 25g/kg/d 5 000 16 3.2 ±1.64*

3.2 小鼠精子畸形实验结果

生半夏水煎液在各剂量组诱发的精子畸形率与阴性对照组相比，无显著性差异(P≥0.05)，见表2。

表2 生半夏水煎液对小鼠精子畸形率影响(s)

表2 生半夏水煎液对小鼠精子畸形率影响(s)

组别 给药剂量 观察精子数畸形精子总数精子畸形率(‰)阴性组(NS)0.25ml/只/d 5 000 144 28.8 ±4.387生半夏高剂量组 25g/kg/d 5 000 131 26.2 ±2.387生半夏中剂量组 5g/kg/d 5 000 135 27.0 ±2.739生半夏低剂量组1g/kg/d 5 000 136 27.2 ±3.033

3.3 小鼠体质量与肝、肾指数变化

各实验组在饲养期间体质量均有增加，生半夏水煎液低、中、高剂量组体质量较阴性组轻，并呈剂量依赖关系，但是P≥0.05，差异无统计学意义。各剂量组的肝脏指数、肾脏指数与阴性组比较，P≥0.05，差异无统计学差异。实验结果表明，生半夏水煎液灌胃10天，对小鼠的体质量、肝肾指数没有影响，见表3。

表3 生半夏水煎液对小鼠体质量和肝肾指数的影响(s)

表3 生半夏水煎液对小鼠体质量和肝肾指数的影响(s)

分组 10天后体质量 肝脏指数(×10－3)肾脏指数(×10－3)阴性组38.18 ±3.226 65.0 ±6.595 16.2 ±1.483生半夏低剂量组 38.14 ±1.865 61.4 ±5.237 17.4 ±0.894生半夏中剂量组 35.96 ±3.091 65.0 ±9.670 16.6 ±2.074生半夏高剂量组35.02 ±1.730 60.8 ±3.701 15.8 ±2.588

3.4 肝脏的HE染色

光镜下观察(见图1):阴性组小鼠肝脏结构完整，肝细胞无水肿、坏死;间质无炎细胞浸润及纤维组织增生，未见血管及血窦扩张;生半夏水煎液低剂量组肝细胞无明显改变;中剂量组肝细胞轻度水肿，肝血窦扩张充血;高剂量组肝细胞水肿，脂肪变性。说明高剂量的生半夏水煎液灌胃10天，对小鼠的肝脏细胞有损伤作用。

3.5 肾脏的HE染色

光镜下观察(见图2):阴性组小鼠肾脏组织结构完整，肾小管无水肿，未见管型，间质未见炎细胞浸润;中剂量组小鼠肾小管局部轻度水肿;高剂量组小鼠肾脏实质内散在灶性淋巴细胞浸润，肾小管内可见管型形成(见图2)。提示高剂量的生半夏水煎液对小鼠肾脏有损伤作用，肾脏是生半夏毒性作用的靶器官之一。

图2 小鼠肾脏HE染色

4 讨论

骨髓多染红细胞的微核试验是目前最常用的哺乳动物体内遗传毒学短期试验，用于评价体细胞的染色体受损情况，当遗传毒物作用有丝分裂期细胞，染色体发生断裂，丧失着丝点，在细胞的有丝分裂后期，染色体应有规律地进入子细胞形成细胞核，而这些受损的染色体断片仍然滞留在细胞质中，形成微核。本实验低剂量和中剂量的生半夏水煎液未能引起骨髓嗜多染红细胞微核率的升高，而高剂量的生半夏可以引起骨髓嗜多染红细胞微核率的升高，说明在正常剂量下和疗程内生半夏对小鼠骨髓细胞没有遗传毒性，而在大剂量下可能对骨髓细胞有潜在的损伤，值得注意。

精子由生殖细胞产生，精子形态的正常与否受基因控制，当遗传毒物引起精子畸形，则提示有相关的基因及蛋白产物的改变［4］，故精子畸形试验可以反映药物对生殖细胞基因的影响。本实验中三组剂量的生半夏水煎液均未引起小鼠精子畸形，考虑对小鼠生殖细胞有遗传毒性的可能性不大。

肝脏和肾脏是药物代谢和排泄的器官，也是对药物进行安全性评价的重要观察对象，在对小鼠肝脏和肾脏的组织形态学的观察结果显示，低剂量组生半夏水煎液对小鼠的肝脏和肾脏没有明显影响;中剂量组对小鼠的肝脏和肾脏影响较小;高剂量组对小鼠的肝脏和肾脏有一定的毒性。

综合上述结果，初步提示大剂量的生半夏水煎液对体细胞可能有一定毒性。进一步研究半夏复方的增效解毒打下基础，并为生半夏的临床合理应用提供参考。

［1］张成铭.大剂量生半夏治疗恶性肿瘤16例［J］.辽宁中医药大学学报，2007，9(6):108 －109.

［2］张民庆，陈华圣，许爱华，等.涤痰祛瘀汤对小鼠肿瘤的抑制作用及其机制探讨［J］.南京中医药大学学报，2001，17(4):221 －222.

［3］王明艳，许冬青，刘华东，等.涤痰化瘀汤对人食管癌Eca－109细胞ras p21 p53基因表达影响的研究［J］.中华中医药学刊，2009，27(3):530－531.

［4］袁伯俊，廖明阳，李波.药物毒理学实验方法与技术［M］.北京:化学工业出版社，2007:294－295.