苏木治疗大鼠膜性肾病的实验研究

胡克杰，赵学谦，宋成收，3

(1.哈尔滨医科大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150086;2.哈尔滨医科大学，黑龙江 哈尔滨 150086;3.齐齐哈尔市第一人民医院，黑龙江 齐齐哈尔 161005)

膜性肾病(membranous nephropathy，MN)常表现为肾病综合征，病变的主要特征是肾小球基底膜增厚，肾小球毛细血管壁的上皮细胞下有沉积物，多数学者认为是一种原位免疫复合物形成致病。国内10 594例肾活检病理资料分析显示，原发性肾小球疾病中MN占第3位(9.54%)，且近10年来明显增多。苏木是我国传统中药材，主要含有黄酮类化合物和甾醇类化合物等，研究证实，其免疫抑制作用略强于雷公藤多甙，与环孢霉素A的对照研究表明其有抗免疫排斥作用，而无明显的毒副作用。本实验以MN大鼠模型为研究对象，观察苏木对其生化指标、病理组织及细胞因子的影响，并与雷公藤多甙等做比较，研究苏木对MN的干预作用及其可能机制，为其临床应用提供可靠的实验基础和理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性Wistar大鼠50只，体质量150～200g之间(购自哈尔滨医科大学附属二院动物实验中心)，于实验前适应性驯养1周，实验期间自由摄食、饮水。

1.2 实验药物及主要试剂 苏木为水提取物(预制成的颗粒冲剂，批准文号0610081，三九医药公司);雷公藤多甙片(黄石飞云制药有限公司);强的松(河南天方药业股份有限公司);天然牛血清白蛋白(NBSA，河北博海生物工程有限公司);大鼠白介素18定量酶检测试剂盒(上海西唐生物科技有限公司)。

1.3 实验动物分组及模型复制 随机挑选大鼠10只作为正常对照组(A组)，其余40只用于复制模型。模型组大鼠使用C－BSA 1mg，加入0.5ml PBS中，与等量的弗氏不完全佐剂混匀成乳白色悬液，在双侧腋下、腹股沟作多点皮下注射。预免疫1周后，每只大鼠尾静脉注射 C－BSA 2.5mg(溶于1ml pH 7.4 PBS中)，每周3次，共3周。成功造模后，随机分为4组:模型组(B组)，苏木组(C组)，雷公藤多甙组(D组)，强的松组(E组)。

1.4 给药方法 A、B组:每只大鼠每日给予生理盐水1ml灌胃;C、D、E组每只大鼠每日分别给予苏木0.5g、雷公藤多甙片1mg、强的松1ml等容灌胃，均给药4周。

1.5 检测指标 观察各组大鼠精神状态、活动情况等一般情况变化，24h尿蛋白排泄量的变化，血清BUN、Cr、TG、TC、ALB 等生化指标的变化。

1.6 大鼠IL－18定量酶检测 采用双抗体两步夹心酶联免疫吸附法(ELISA)。

1.7 肾脏病理检测 肾脏组织用4%多聚甲醛中固定过夜;流水冲洗标本6h后，酒精梯度脱水;置60℃蜡箱浸蜡4h，包埋蜡块;30%明胶涂片，凉干;切片，烤片;脱蜡至水;苏木素及伊红染色;染色后脱水，透明;中性树胶封片;镜下观察肾脏病理改变。

2 结果

2.1 大鼠一般情况 造模后约1周均出现精神不振，反应迟钝，活动量少，摄食减少，尿量减少等现象。第4至6周，模型对照组出现皮下、阴囊水肿及腹水。第7、8周，C、D、E组大鼠状态较前略好转，摄食逐渐增加，体重增长，腹水、阴囊水肿明显消退。

2.2 生化指标改变 血清BUN、Cr水平5组间无明显差异。模型组TG、TC较正常组均明显上升(P＜0.05)，ALB水平较正常组明显下降(P＜0.05)。各治疗组治疗后TG水平与正常组相比均有升高，经药物治疗后下降，但与模型组相比差异无显著性。各治疗组治疗后的TC水平明显低于模型组(P＜0.01)，基本恢复正常。治疗组的低蛋白血症在治疗后有显著改善(P＜0.01)。各治疗组间各项指标的差异均无统计学意义。结果见表1。

表1 各组大鼠生化指标的变化(s，n=10)

表1 各组大鼠生化指标的变化(s，n=10)

注:与正常组比较，△P＜0.05;与模型组比较，*P＜0.01。

组别指标 正常组 模型组 苏木组 雷公藤组 强的松组BUN(mmol/L)7.01 ±0.87 7.27 ±0.86 7.22 ±0.90 7.53 ±0.67 7.28 ±0.84 Cr(umol/L)71.54 ±6.85 77.58 ±7.45 75.42 ±5.63 76.20 ±5.52 75.26 ±5.71 TG(mmol/L)1.14 ±0.12 1.82 ±0.24△ 1.48 ±0.50 1.54 ±0.45 1.68 ±0.38 TC(mmol/L)2.12 ±0.43 3.89 ±0.45△ 2.42 ±0.53* 2.40 ±0.29* 2.51 ±0.35*ALB(mmol/L)40.60 ±3.42 25.76 ±2.54△ 30.36 ±2.87* 31.22 ±1.74* 30.98 ±2.69*

2.3 24h尿蛋白排泄量变化 实验第8周末与第4周末比较，模型组尿蛋白定量稍有回落，但差异无显著性;各治疗组尿蛋白定量与治疗前比较有明显降低(P＜0.01);第8周末各治疗组与模型组比较有显著差异(P＜0.05)，即治疗组尿蛋白水平显著低于模型组，各治疗组间两两比较差异无统计学意义。结果见表2。

表2 大鼠24h尿蛋白定量(U－TP)的检测结果(s)

表2 大鼠24h尿蛋白定量(U－TP)的检测结果(s)

注:与治疗前(4周末)组比较，*P＜0.01;与模型组比较，△P＜0.05。

组别 n 4周末 8周末正常组10 6.10 ±1.54 6.60 ±1.78模型组 10 182.20 ±5.26 183.40 ±10.35苏木组 10 182.40 ±4.92 120.20 ±5.76＊△雷公藤组 10 181.25 ±4.50 118.30 ±4.45＊△强的松组 10 182.55 ±5.30 122.00 ±4.20＊△

2.4 各组大鼠IL－18水平变化 模型组及治疗组血IL－18水平均显著高于正常组(P＜0.01)，各治疗组血IL－18与模型组比较均降低(P＜0.05)，但各治疗组间相比无明显差异。结果见表3。

表3 大鼠白介素18定量酶检测结果(s)

表3 大鼠白介素18定量酶检测结果(s)

注:与正常组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与模型组比较，△P＜0.05。

组别 n IL－18(ng/L)正常组10 52.64 ±3.26模型组 10 145.18 ±2.07＊＊苏木组 10 98.02 ±2.82＊△雷公藤组 10 97.93 ±2.54＊△强的松组 10 100.57 ±3.09＊△

2.5 肾脏组织学改变 模型组肾小球体积明显增大，球内细胞增多，毛细血管壁明显增厚，管内出现较多红细胞，肾小球周围大量炎性细胞浸润，分叶明显，基底膜弥漫性增厚，系膜细胞增生，肾小管近曲小管水肿。治疗组肾小球体积改变不明显，球内细胞数不同程度减少，以激素组明显，浸润的炎性细胞也相应减少。苏木组和雷公藤组表现相似，毛细血管内红细胞数明显减少，肾小球周围仅有少量炎性细胞浸润。见图1。

图1 各组大鼠肾脏组织学改变

3 讨论

据国内肾活检病理结果报告，MN占成人原发性肾小球肾炎的8.8% ～11.9%，居第3位［1］，是导致慢性肾衰竭的主要原因之一。目前普遍认为，MN的发病机制为上皮下免疫复合物沉积所导致的基底膜增厚和足细胞损害，基底膜的损害正是局部形成的原位免疫复合物沉积的结果［2－3］。本研究采用C－BSA免疫大鼠的方法成功复制MN模型，其发病机制、病变稳定而典型，病理变化较一致。

几乎所有肾脏固有细胞，包括系膜细胞、上皮细胞、内皮细胞等都有产生细胞因子的能力，并且同时又是细胞因子生物学活性的靶细胞［5］。IL－18是近年来发现的具有多种免疫调节功能的细胞因子，主要由活化的巨噬细胞产生，有许多生物学活性:刺激T细胞增殖;诱导T细胞和自然杀伤NK细胞产生IFN－γ;使T细胞分泌IL－2、GM －CSF和TNF－α;诱导T细胞和NK细胞表达Fas配体等。IL－18在MN中的作用机制主要可能为:增强Thl免疫应答的调节作用［5］;促进血管通透因子(VPF)表达［6］;导致在功能上Thl/Th2的比例失调等［5］。

近年来药理及临床研究证实，苏木在免疫的细胞和分子水平均有抑制作用［7－8］，另外尚有抗炎、改善微循环［9］、抗氧化［10］等作用。本实验研究结果显示，通过干预治疗后，苏木组和激素组尿蛋白定量均明显低于模型组，提示苏木可以减少MN蛋白尿，从而延缓肾病的进展;苏木组血清ALB明显高于模型组，表明苏木能提高MN大鼠的血浆蛋白水平，其原因可能与减少蛋白尿，改善肝脏的白蛋白合成和增加白蛋白的摄入，从而提高了血浆白蛋白的水平有关;苏木组病理改变程度明显减轻，可见苏木能抑制膜性肾病大鼠的系膜细胞增生，减少免疫复合物形成，从而延缓肾小球硬化和肾间质纤维化的进程;此外，还可能通过增加肾血流量，提高肾小球滤过率，改善其微循环，或部分调节组织的修复与再生，从而修复部分受损肾脏组织。本实验发现，模型组IL－18水平显著升高，与各治疗组存在显著差异，而苏木组与其他治疗组之间IL－18的表达并无明显差异，说明三种治疗均具有抑制IL－18分泌的作用，苏木与强的松组、雷公藤多甙相比并无优势。而苏木抑制IL－18分泌的作用具体机制尚不明确，需要进一步的探索与研究。

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