HIV－1NefR作用机制的研究进展＊

陈 超，杨微波，张宏丽，李俊敏，戴 虹，张 禄 综述，游 晶审校

（昆明医学院第一附属医院感染性疾病科 650032）

人类免疫缺陷病毒（HIV）在病毒学上属于逆转录病毒科，慢病毒属。目前发现两种HIV，分别为人类免疫缺陷病毒－1（HIV－1）和人类免疫缺陷病毒－2（HIV－2），两者具有相似的病毒结构和传播途径。HIV－2毒力和传播力都低于HIV－1，它引起的艾滋病（AIDS）病程也较缓和。HIV－1是目前引起全世界AIDS流行的主要病原，其感染人群占全球HIV感染者的90%以上［1］。目前HIV的研究也是以HIV－1为主进行的。

人类免疫缺陷病毒附加蛋白Nef（HIV－1Nef）是HIV附加基因编码的调节蛋白。HIV－1NefR在从HIV感染发展到AIDS的整个进程中起着至关重要的作用［2］。目前研究认为Nef的功能主要是在下调细胞膜表面受体、干扰细胞内信号转导途径、促进病毒释放、增强HIV的转录、增加病毒基因表达等方面发挥重要作用。另外在Nef各种形式突变以及对HIV的影响方面也有不少的研究报道，在这方面有可能为HIV疫苗的设计带来新的希望。

1 Nef概述

1.1 Nef的概念 Nef是HIV－1基因组编码的一种多功能的辅助蛋白。它在整个病毒的复制阶段持续性表达，从而在病毒复制周期的各个阶段发挥重要的作用，并对HIV－1体内的致病性以及AIDS进展都有重要的影响。

1.2 Nef的结构 Nef是由nef基因编码的含有206个氨基酸、相对分子质量为25×103～27×103的辅助蛋白。人们通过核磁共振和X晶体衍射认识到Nef蛋白是由6个α螺旋、1个β折叠及5个β型反平行的单链组成。N端aa6～22形成一个规则的α螺旋；核心区域有折叠完好的结构，aa69～78为富含脯氨酸的序列，可形成Ⅱ型聚脯氨酸螺旋，其中SH3结构域（aa70～77）是酪氨酸蛋白激酶（Src）家族的主要结合位点；SH3结构域后面是2个α螺旋（81～120，αA和αB）、1个四股反向平行的β片层（aa121～186，βA～βD）以及另外2个α螺旋（aa187～203，αC和αD）；aa60～71及aa149～180形成暴露的，可溶性弹性环状结构；3个邻近的螺旋（aa70～120）形成一个容易结合药物的空穴，可阻断Nef与Src激酶家族间相互作用［3］。

2 HIV－1NefR与细胞膜表面相关受体的作用

目前研究表明，HIV－1Nef可以通过对CD4、人类组织主要相容性复合体－1（MHC－1）类分子等细胞膜表面分子的下调扰乱机体内免疫平衡，降低免疫细胞的功能。

2.1 与CD4分子受体的作用 CD4分子是由55×103的Ⅰ型细胞表面糖蛋白组成的MHC－2限制性细胞表面T细胞受体［4］，如辅助T淋巴细胞、单核巨噬细胞以及可以作为HIV或猴免疫缺陷病毒（SIV）的主要细胞受体。

HIV－1感染细胞的过程首先是 HIV－1的糖蛋白120（gp120）与宿主细胞第一受体（CD4分子）结合，然后与其第二受体（CXCR4或CCR5）结合，从而使gp120构象改变与糖蛋白41（gp41）分离，HIV与宿主细胞膜融合进入细胞。因此，CD4分子是HIV病毒与宿主细胞结合的第一受体，下调宿主细胞CD4分子可以预防病毒包膜被宿主细胞CD4分子隔离而影响病毒颗粒的装配，从而增加病毒颗粒的释放。下调宿主细胞表面的CD4分子还可以预防宿主细胞的二重感染，从而减少宿主细胞的过早死亡［4］。目前认为，HIV－1Nef主要是通过诱导细胞膜表面CD4分子的内吞作用和阻碍细胞膜受体的转运来下调细胞表面的CD4分子［5］。

Chauduri等［2］通过RNA干扰技术发现Nef下调CD4受体过程中需要接头蛋白（AP）或AP的相关蛋白参与。CD4蛋白细胞质尾部近膜区域有双亮氨酸残基，正常情况下该位点与Src激酶家族的p56Lck结合后被封闭，阻止AP介导的内化［7］。Nef WL（57～58）和核心区 G95、L97、R106及 L110残基直接结合CD4细胞质区双亮氨酸基序，磷酸化其细胞质尾区Ser408，导致CD4被内吞［6］。最近有报道称应用酵母三向杂交法显示:Nef与AP1、AP3有相互作用，而与AP2和AP4之间没有相互作用［6］。据观察分析在Nef与AP1和AP3的μ亚基之间有很强的相互作用参与反面高尔基网状结构（TGN）和内体性溶酶体之间的运输［6］。最近研究发现，HIV Nef蛋白在下调细胞表面CD4分子过程中除了依赖AP外，同时还依赖于泛素化赖氨酸残基K144［7］。在另外一些调节蛋白，如液泡ATP激酶亚基VIH对Nef介导的细胞表面CD4分子的下调也起到一定的作用［8］。VIH是AP包裹小泡的一部分，对于体内溶酶体的酸化是必需的。酵母双向杂交显示，Nef的C末端柔韧环与V1H结合，同时V1H也具有AP－2μ2链的结合位点，通过AP2将CD4与AP连接［9］。另外也有研究表明，Nef可以使CD4受体分子通过多泡体通路，将其运输至溶酶体，从而使CD4受体分子在溶酶体内被降解［10］。

2.2 与CD28分子受体的作用 CD28表达于外周血中几乎所有CD4阳性T细胞和50%的CD8阳性T细胞表面。此外，浆细胞和部分活化B细胞也表达CD28。其配体是表达于B细胞和抗原提呈细胞（APC）表面的B7家族分子。CD28与B7家族构成了活化T细胞的重要的第二信号。Nef对CD28的下调可以使T细胞的激活受到抑制，但具体对病毒的意义还不十分清楚，有可能促进感染HIV－1的T细胞从APC释放，加速感染HIV－1的T细胞进入循环，从而加强病毒的传播。目前认为Nef对CD28的下调主要是靠AP－2在CD28和Nef之间相互作用完成的［11］。Nef的这种活性现象存在于多个保守的HIV－1和SIV病毒株中。165和166位双亮氨基酸（LL165／166）残基和194位组氨酸（His194）残基为 Nef下调CD28起了关键作用［12］。

2.3 与MHC分子的作用 MHC分子即为主要组织相容性复合体，可以分为 MHC－1和 MHC－2两种类型。其主要生物学功能是通过提呈抗原而激活T细胞参与适应性免疫应答。Nef对MHC分子的下调可以使被病毒感染的宿主细胞逃脱细胞毒性T细胞即TCL细胞的攻击，这对HIV感染宿主细胞以及发展成为AIDS都具有至关重要的作用。这也是病毒逃逸免疫机制的经典途径之一。但目前Nef对MHC分子的下调机制仍不十分清楚。

2.3.1 与 MHC－1分子的作用 Nef对 MHC－1分子的作用并不是影响MHC－1的合成以及其在细胞内高尔基体和内质网之间的运输，但可以通过阻碍MHC－1分子高尔基体运输至细胞表面从而导致MHC－1分子在高尔基体网状结构内的蓄积。也可通过加速细胞膜表面已经表达的成熟 MHC－1分子的内吞作用和加速对其反向运输至反面高尔基体网状结构而发挥作用。普遍认为，二磷酸腺酐（ADP）糖基化因子Arf6可以促进细胞表面MHC－1的下调，其机制可能为Nef与酸弗林蛋白酶酸性氨基酸族分选蛋白－1（PACS－1）结合启动ADP糖基化因子（Arf6）的内吞途径，从而下调细胞表面MHC－1分子至反面高尔基网。而Arf6介导的内吞作用主要是通过GTP／GDP与Arf6的结合状态来进行调节的，在此过程中还受到Nef蛋白的SH3结构域连接的PxxP和 Met20的控制［13］。Larsen等［14］通过抑制Arf6上游活化剂磷酸肌醇三磷酸激酶发现并不能影响细胞表面 MHC－1分子的内吞过程。但是Arf6的活性有助于使内吞的MHC－1类分子转运至高尔基网。因此，认为Nef介导 MHC－1类分子的下调机制明显依赖于Arf6是由于其活性的降低可以非特异性干扰细胞内质膜的转运功能。另外，通过消除Nef蛋白N末端豆蔻酰化的结构将完全废止MHC－1和CD4分子的下调，从而保护CTL细胞、T辅助细胞及B细胞表位［15］。说明Nef的豆蔻酰化同样是促进MHC－1下调的重要结构。Nef下调MHC－1的机制有助于受染CD4阳性细胞躲避CTL裂解的作用［16］，从而利于促成病毒库和潜伏性感染。Jimmy和Jung［17］通过运用一种小分子抑制剂2C干扰Nef与Scr家族激酶之间相互作用，成功抑制了被HIV感染的CD4阳性T细胞表面MHC分子的下调。这有可能为治疗和控制AIDS探索出新的方法。

2.3.2 与MHC－2分子的作用 MHC分子主要通过提呈抗原肽而激活T细胞，参与适应性免疫应答。其中MHC－2类分子主要参与CD4阳性Th细胞的外源性识别。MHC－2存在于所有能被HIV感染的细胞类型当中。

Nef对MHC－2分子抗原提呈的干扰作用主要通过两种不同机制实现的，其机制包括了下调细胞表面表达的成熟MHC－2分子和上调 MHC－2相关不变侧链在细胞膜上的表达。MHC－2相关不变侧链是MHC－2对抗原处理过程中相关的伴侣蛋白，其作用是抑制抗原肽与 MHC－2的结合以及增强MHC－2分子的折叠［18］。因此Nef通过增强 MHC－2的不变链在细胞膜上的表达从而减弱MHC－2的抗原提呈作用。在此过程中，Nef与AP连接模体的双氨基酸区域LL165／166以及AP与MHC－2分子细胞质尾部连接区域的部分双亮氨酸残基DDQRDL1（8）和 EQLPML（17）对 Nef上调细胞表面 MHC－2分子不变侧链起到了十分关键的作用［19］。此外，Nef对MHC－2不变侧链的上调依赖Nef中等水平量的表达，因此在长期非进展性患者体内不会使MHC－2不变侧链表达的上调［20］。Nef除了上调 MHC－2不变侧链外还可以下调细胞表面成熟的MHC－2分子，其机制目前认为并不是通过通常的内吞途径实现的，但是其具体机制还不十分明确［21］。深入研究Nef对细胞表面分子的下调机制，尤其是针对Nef与表面分子结合位点的抑制性研究可为治疗HIV－1感染提供新的理论依据［22］。

3 HIV－1NefR增强病毒的感染性

目前有研究已证实了HIV－1的Nef可以增加HIV的感染性并促进HIV的释放［23］。Nef可以增强病毒从脂质筏出芽的方式来增强病毒的感染性。有研究发现，HIV病毒包膜含有丰富的神经节苷脂，正是胞膜脂质筏的主要组成元件，其功能与增强HIV的感染性有直接的相关性［24］。另外有研究发现动力蛋白2（Dyn2）是细胞内小泡转运的关键调节因子。它能与Nef的辅助蛋白共同作用增加病毒的感染性。用小RNA干扰抑制Dyn2或者敲除Dyn2基因将阻碍HIV－1的感染［25］。说明Dyn2在Nef增强HIV感染的过程中起着关键的调节作用。

Bergonizini等［26］通过观察发现在长期的非进展性HIV－1感染患者体内Nef有自然消除的现象。经进一步的研究证明，消除Nef可以减弱HIV－1的感染能力，但其机制还不是十分清楚。可能与Nef参与的信号转导通路以及宿主细胞蛋白激酶的相互作用有关。

目前，在艾滋病相关性脑病方面的研究表明，HIV Nef蛋白在其发病机制中也发挥着重要作用［26］。当外周单核巨噬细胞被HIV感染后，可通过血脑屏障进入脑组织当中，进而感染脑组织中固有单核巨噬细胞，从而引起其释放各种炎性因子，引起相应的临床症状。HIV Nef能通过促进被感染的单核巨噬细胞释放各种炎性介质及肿瘤坏死因子（TNF）的表达［27］，而在其发病机制中发挥作用。

4 HIV－1NefR与细胞信号转导之间的作用

机体内的细胞可识别与之接触的细胞所呈递的信号，或者识别周围环境中存在的各种化学和物理信号，并通过受体将这些信号传入细胞内，产生各种信息分子和有规律的级联反应，从而改变细胞内的某些代谢过程，调节细胞的生长速度，甚至诱导细胞死亡。这种针对外源信息所发生的细胞应答反应的全过程称为信号转导。在人体免疫系统中，尤其是T细胞在识别外源性抗原并被激活的过程中细胞信号转导起到了至关重要的作用。

与T细胞结合抗原及其被激活过程密切相关的信号转导分子主要有Src家族、ZAP70家族和Tec家族。其中Src家族中Fyn主要与T细胞抗原受体结合存在，Lck主要与辅助受体CD4／CD8结合存在。当T细胞抗原受体接受抗原刺激活化时，两者均可以发生酪氨酸磷酸化并得以活化，再作用于下游底物分子使之磷酸化。ZAP70可以与T淋巴细胞的抗原受体的ξ亚单位相结合的70×103的蛋白。T细胞受体的酪氨酸被磷酸化后，可以结合ZAP70使之活化。Tec家族也是一类重要的蛋白酪氨酸激酶，它们在细胞的发育和活化过程中是重要的信号转导分子，但具体功能还不十分清楚。

Nef缺乏任何催化活性，但其在宿主细胞内可以起到影响激酶以及其他一些信号转导通路的作用［29］。分子质量分别为62×103和72×103的双磷酸蛋白被称为Nef相关激酶（NAKs）。其中一种蛋白是P21活性激酶（PAK2），可以直接影响细胞骨架形态和细胞产生的凋亡信号［30］。Nef可以影响PAK2调节由细胞质向细胞核转运的细胞信号分子以及诱导改变细胞骨架和细胞的转录、反转录中的作用。另外Nef还可以通过诱导感染以及未被感染的免疫细胞表达Fas及其配体FasL从而导致免疫细胞特别是HIV特异性细胞毒性T细胞（CTLs）的凋亡，从而使HIV获得免疫逃逸。

5 HIV－1NefR在预防和治疗作用中的展望

Nef通过下调细胞表面CD4和CCR5等受体分子以及MHC－1和成熟的 MHC－2类分子来逃脱宿主免疫攻击、促进病毒释放、增强病毒感染性等众多生物学功能。其在AIDS的发病机制以及从HIV感染发展成为AIDS的过程中起着重要的作用。正因为其关键作用为人们预防HIV感染和治疗AIDS找到新的希望。

Balog和Minarovits［31］通过对长期非进展性HIV感染者的研究发现Nef剔除的HIV或者是高度变异后出现基因组缺陷的HIV（dHIV）能够干扰野生型HIV的复制。因此人们可以通过人工处理的dHIV注射入HIV感染者的体内能够减缓发展成为AIDS的进程甚至有可能起到治疗AIDS的作用。目前，在疫苗研究方面还没有找到可很好预防HIV感染的疫苗，其主要障碍是HIV缺乏固有的和获得性的保护性免疫能力［32］。不过近年针对Nef疫苗的研究也有很多成果。Erfle等［33］发现，在病毒的V2区域删除外膜蛋白后可以抑制Nef的产生和释放，由此可能为Nef的免疫疫苗找到新的方法。

由于对Nef在细胞内的具体作用过程认识还不十分清楚，限制了针对Nef这一潜在的靶点治疗和预防手段的发展。随着对Nef研究的不断深入，必将为人类预防HIV感染，治疗AIDS提供更多更好的途径和方法。

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