乳酸链球菌素脂质体的研究

金慧伟，杨晓刚，芮昶，关荣发，*，黄斯，吴知盼

（1.中国计量学院生命科学学院，浙江 杭州 310018；2.浙江理工大学，浙江 杭州 310018；3.杭州市质量技术监督检测院，浙江 杭州 310019）

乳酸链球菌素脂质体的研究

金慧伟1，杨晓刚2，芮昶3，关荣发1，*，黄斯1，吴知盼1

（1.中国计量学院生命科学学院，浙江 杭州 310018；2.浙江理工大学，浙江 杭州 310018；3.杭州市质量技术监督检测院，浙江 杭州 310019）

乳酸链球菌素是一种具有良好防腐效果的天然生物保鲜剂，但其易被水解并与食品基质发生反应,不太稳定等问题降低了其保鲜效果，而利用脂质体包埋技术可有效地解决乳酸链球菌素使用中存在的问题，本文将对乳酸链球菌素脂质体的特点及其制备的影响因素进行阐述。

乳酸链球菌素；脂质体；特点；制备

近年来，越来越多的食品企业和消费者对食品安全日益重视，尤其是食品行业中防腐剂的安全问题。乳酸链球菌素是一种公认的高效、无毒的天然防腐剂，能抑制大部分革兰氏阳性菌及其芽孢的生长和繁殖，从而能有效抑制有害细菌的生长和繁殖，使产品保质期延长4倍～6倍，有利于产品的贮存和运输。同时，它不仅具有较好的防腐抑菌作用，而且能减弱热处理强度，降低加工成本，改善食品风味、外观和营养价值[1]。但其在应用中还存在着稳定性差的问题，如自身的降解，细菌素和食物成分潜在的相互作用等问题，导致其抗菌活性的下降。

脂质体同时含有油脂和水，可以用来运送和释放可溶性和脂溶性的两性物质[2]。在传统食品工业中，关于脂质体的研究，主要集中在对蛋白质、酶、维生素、抗氧化剂和风味组分等成分转运的研究上。由于脂质体可包埋水溶性材料，使被包埋的材料具有更大的稳定性，因此脂质体包埋技术比其他包埋技术（喷雾干燥、挤压、硫化床）具有更大的优势。研究证明，脂质体包埋的物质能在环境和化学变化时保持稳定，包括酶和化学修饰，甚至在极端pH和温度下都能够得到缓冲[3]。脂质体因其可用天然成分制备的优点，据国外资料报道，脂质体技术可用于包埋乳酸链球菌素，解决乳酸链球菌素应用中存在的问题，如蛋白质降解及与食物成分的相互作用[4]。

1 乳酸链球菌素脂质体的特点

脂质体的主要作用之一是包埋浓缩化合物，可以解决抗生素和磷脂之间的静电和疏水相互作用的问题。由34个氨基酸组成的乳酸链球菌素，是分子量为3.5 ku的阳离子组成的抗菌肽[5]。乳酸链球菌素能被包埋在脂质体的内水相，也能被固定到脂质体膜上。研究发现，与其他包埋率低的前体脂质体（9.5%～26%）相比，具有高包埋率的乳酸链球菌素脂质体（34.6%），是由前体脂质体h制备的，其负电荷的磷脂（占总磷脂含量的1%）含量较低，含两性离子的磷脂（占总磷脂含量的85%）含量较高[6]。与其他脂质体相比，由于乳酸链球菌素会与带正电的阳离子囊泡发生静电斥力作用，故含硬脂酰基胺的阳离子囊泡具有较低的包埋率（11.7%～13.6%）。与此相反的是，包埋乳酸链球菌素的含有十六烷基磷酸盐的阴离子囊泡，其包埋率（50.1%～54.2%）是最高的，对于其他阴离子囊泡来说，其包埋率也是较高的，说明囊泡包埋效率的增加与静电相互作用有关。

脂质体表面电荷主要取决于磷脂的组成[7]。在细胞膜模型中，含磷脂双层膜的乳酸链球菌素，其联合作用主要取决于薄膜表面电荷，研究发现，含有阴离子的乳酸链球菌素，相比含中性磷脂的脂质体，能更加有效地结合[8]。具体来说，由于C-末端包含了乳酸链球菌素分子在正电荷的重要组成部分，其可用来调节乳酸链球菌素与细胞膜的静电相互作用[5]。已证实，膜泄漏的程度与肽结合程度成正比，故含阴离子脂质的乳酸链球菌素Z有高渗透力，而含中性脂质的有低渗透力[9]。因此，将乳酸链球菌素包埋在带负电荷磷脂（如前列腺素）头基上，可能会导致不稳定的脂质体孔隙的形成[10]。研究发现，前列腺素脂质体能有效地释放内含物，包埋物质由聚碳酸脂和前列腺素（质量比为6:4）混合组成的乳酸链球菌素脂质体能有效地从孔隙结构释成出来乳酸链球菌素[11]。与游离乳酸链球菌素的相比，乳酸链球菌素的聚碳酸脂脂质体不能有效地抑制目标病原体（32℃48 h），但由聚碳酸脂和前列腺素（质量比为8:2或6:4）制备的脂质体却有着显著的抑制作用。研究发现，与其他脂质体相比，由脂质前体制备的、带负电荷及低含量磷脂的脂质体，不易受到乳酸链球菌素不稳定作用的影响。

2 乳酸链球菌素脂质体制备效果的影响因素

2.1 胆固醇对乳酸链球菌素脂质体制备的影响

胆固醇一般会降低脂质体制备中的包埋率[11]，而氢化脂质体的包埋率则相对高些。研究结果也证明了这一点，用氢化聚碳酸脂:胆固醇（质量比为8:2）组成的乳酸链球菌素脂质体的包埋率高于聚碳酸脂和胆固醇制备的脂质体[12]。研究表明，聚碳酸脂脂质体中乳酸链球菌素的浓度高于聚碳酸脂:胆固醇（质量比为7:3）制备的脂质体，但两者的李斯特菌抗菌活性相似。胆固醇能抑制乳酸链球菌素从脂质体中渗透出来[11]，这说明胆固醇是稳定脂质体的有效成分[13]。试验表明胆固醇对乳酸链球菌素包埋率和乳酸链球菌素渗漏率的影响原理相同，原因在于胆固醇可以增强脂质链的协调性，这种更紧密的包埋可以减少脂质的亲和力，而乳酸链球菌素包埋到脂质膜则会降低乳酸链球菌素向外渗透的程度。

2.2 乳酸链球菌素的浓度对其脂质体制备的影响

乳酸链球菌素的浓度是影响包埋率的另一个重要因素，浓度的提高可以增加包埋率。研究发现，吸附到硅表面上的乳酸链球菌素数量的提高，与乳酸链球菌素溶液浓度的增加成正相关，原因在于乳酸链球菌素脂质体多层膜的构造所致。乳酸链球菌素溶液的pH，也可能对乳酸链球菌素脂质体产生较大的影响。研究发现，pH降低（pH范围：3.6～6.6）促进由前体脂质体制备的乳酸链球菌素脂质体的形成[6]。

3 乳酸链球菌素脂质体在食品工业中的应用

乳酸链球菌素作为一种新型的天然防腐剂，在国际上已得到认可，现已广泛应用于乳制品、鲜牛奶、奶粉、酸、奶、干酪及罐头食品、肉制品饮料等领域。乳酸链球菌素被批准用于食品，所以对乳酸链球菌素Z研究较多。在乳酸链球菌素脂质体研究中，用常见的食源性致病菌—李斯特菌作为指示菌株，研究发现，尽管乳酸链球菌素Z脂质体降低了乳酸菌的活菌数，但对切达奶酪的发酵影响不大，且其在温度条件不同的整个切达奶酪制作工艺中是稳定的。

Benech等（2002）研究了乳酸链球菌素Z的脯氨酸脂质体在牛乳制备干酪的生产过程中的效果，试验检测了切达干酪6个月成熟过程中抗菌活性、理化性质和感官品质的变化[13]。结果发现，6个月后，每克奶酪中形成的李斯特菌的数量少于10个菌落形成单位，乳酸链球菌素脂质体中的乳酸链球菌素的活性恢复到其初始的90%，而仅将乳酸链球菌素与发酵剂进行简单混合的奶酪中，每克奶酪中含有103～104菌落形成单位的李斯特菌，且乳酸链球菌素的活性只能恢复到起初的12%。在奶酪成熟过程中，对脂质体包埋的乳酸链球菌素和固定在线性脂质体结构上的乳酸链球菌素进行了试验，发现它们主要分布在与脂肪或酪蛋白接触面和乳清囊泡中，而由nisinogenic菌株产生的乳酸链球菌素在新鲜奶酪基质均有分布，但在陈化奶酪中却集中在脂肪区域。因此，包埋和固定于脂质体膜是运输乳酸链球菌素的另一种途径，可提高乳酸链球菌素的稳定性和利用率，将乳酸链球菌素脂质体分散在奶酪基质中，也可使奶酪发酵剂不受乳酸链球菌素的不利影响[1]。为进一步研究乳酸链球菌素脂质体在奶酪中的应用前景，Benech等（2003）的实验表明，乳酸链球菌素脂质体不影响蛋白质流变学、感官特性及其水解作用。nisinogenic菌株掺入到奶酪发酵剂后，在不改变奶酪流变特征的情况下增强了其对乳蛋白和乳脂肪的分解作用[14]。

4 结论

乳酸链球菌素脂质体在保证乳酸链球菌素控制食品中腐败菌和致病菌的同时，可有效地降低食品生产加工过程中不同环境对乳酸链球菌素的破坏，如酸碱及热处理对其的影响[7]，提高乳酸链球菌素脂质体的稳定性和包埋率，有利于乳酸链球菌素在食品基质中的稳定性[6]。由于乳酸链球菌素可溶解在水相和脂相的脂质体中，并且有着比较高的短期（通过包埋的乳酸链球菌素释放）和长期（细胞膜固定乳酸链球菌素的解吸）的抗菌作用，因此可增强食品的安全性以及提高其货架寿命[8，11，13]。

研究表明，乳酸链球菌素脂质体技术是一种用于控制食品中腐烂菌和病原微生物的有力工具[6]。目前研究表明，胆固醇有稳定脂质体囊泡的作用，但需要量比较大[15]，开展胆固醇替代品的研究是其研究方向之一；制备脂质体的另一成分卵磷脂是价廉的天然原料，可从大豆或蛋黄分离，其成本不高[12，16]。目前用来制备脂质体的原料都是安全的，且原料和乳酸链球菌素均已获得监管部门的批准，允许在食品工业中使用[3]。目前迫切需要解决的问题是降低其成本，使其在可接受的成本内扩大乳酸链球菌素脂质体的使用范围。乳酸链球菌素脂质体有着较高的包埋率和较强的抗菌活性，目前已广泛应用于乳制品工业中，主要用来抑制李斯特菌的生长，延长产品货架期。总之，乳酸链球菌素脂质体作为一种新型的食品防腐剂，应用前景十分广阔。

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Study of Nisin Liposome

JIN Hui-wei1,YANG Xiao-gang2,RUI Chang3,GUAN Rong-fa1,*,HUANG Si1,WU Zhi-pan1
（1.College of Life Sciences,China Jiliang University,Hangzhou 310018,Zhejiang,China;2.Zhejiang Sci-Tech University,Hangzhou 310018,Zhejiang,China;3.Hangzhou Institute of Calibration and Testing for Quality and Technical Supervision,Hangzhou 310019,Zhejiang,China）

Nisin is a natural biological preservative with good preservative effect,but its unstabitily,easyhydrolysis and reacting with the food matrix reduce its preservation effect.Applying liposome technology can solve the problems in utilization of Nisin.In this paper,the characteristics and influencing factors of preparation of Nisin were expounded.

Nisin;liposome;characteristic;preparation

浙江省级公益性技术应用研究计划项目（2012C22052）；浙江省质监局项目（20110223）；杭州市科技计划项目（20091832B50）；杭州市科技计划项目（20101032B18）

金慧伟（1991—），男（汉），本科，主要研究方向：脂质体。

*通信作者：关荣发（1975—），男，副教授，博士，硕士生导师，主要研究方向：食品保鲜与食品安全。

2012-01-17