培养方式对乳酸杆菌和双歧杆菌检出率的影响

祁 茹 温建新 肖 宇 林英庭

（青岛农业大学动物科技学院，青岛 266109）

目前，在微生物活菌计数和检测中，常用方法有倾注平板法、平板涂布法、平板划线法、滤膜法、MPN法和亨氏管法等。张银旺（2005）[1]用平板涂布法培养双歧杆菌计数，潘灵辉（2005）[2]和赵晓静（2005）[3]等用平板涂布法培养乳酸杆菌和双歧杆菌并计数。本文研究涂布、倾注和亨氏管法3种不同培养方式对厌氧微生物乳酸杆菌和双歧杆菌检出率的影响。

1 材料与方法

1.1 样品

崂山奶山羊新鲜粪便

1.2 培养基

1.2.1 乳酸杆菌计数用培养基 MRS琼脂培养基，购于青岛海博生物技术有限公司，配方（g/L）：水解酪蛋白：10.0；大豆胨：5.0；酵母粉：2.0；葡萄糖：5.0；L-半胱氨酸：0.5；磷酸氢二钾：2.0；氯化镁：0.5；硫酸锌：0.25；氯化钙：0.15；氯化铁：0.000001；琼脂：20.0；吐温80：1.0。pH值6.5 ± 0.1。

1.2.2 双歧杆菌计数培养基 TPY琼脂培养基，购于青岛海博生物技术有限公司，配方（g/L）蛋白胨：10.0；酵母浸粉：8.0；葡萄糖：4.0；磷酸氢二钾：20.0；柠檬酸氢二铵：2.0；乙酸钠：2.0；硫酸镁：5.0；硫酸锰：0.04；琼脂：14.0；吐温80：1.0。pH值6.5 ± 0.2。

1.3 计数及鉴定

按照GB4789.2-2010和GB 4789.35-2010进行。

1.4 试验方法

稀释液的制备：称取1 g新鲜粪便放入9 ml无菌生理盐水中，充分混匀，制成1∶10的样品匀液。用移液器移取1∶10的样品匀液1 ml，沿管壁缓慢注于盛有9 ml稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管使其混合均匀，制成1∶100的样品匀液。依次类推，制备10倍系列稀释样品匀液[4]。

1.4.1 平板涂布法 预实验选取3个适宜的稀释度（每个稀释度2个重复），同时作灭菌生理盐水空白对照。每个稀释度吸取0.1ml样品匀液滴于预先倾注好的培养基表面中央位置，用无菌的L棒均匀涂布，室温静置5～10 min后将平板倒置于厌氧培养罐中37℃恒温培养48h±2h后计数。

1.4.2 倾注平板法 预实验选取3个适宜的稀释度（每个稀释度2个重复），同时作灭菌生理盐水空白对照。每个稀释度吸取0.1 ml样品匀液对号放入编好号的无菌平皿中，转动平皿使其均匀分散，尽快向平皿中导入融化后冷却至45℃左右的培养基约15 ml，再次转动平皿使培养基与菌液混合均匀。待培养基凝固后，将平板倒置于厌氧培养罐中37℃恒温培养48 h±2 h后计数。

1.4.3 亨氏管培养法 预实验选取3个适宜的稀释度（每个稀释度2个重复），同时作灭菌生理盐水空白对照。每个稀释度吸取0.1 ml样品匀液，加入装有5 ml无菌无氧培养基（融化后冷却至45℃左右）的亨氏管中，将其平放于盛有冰块的盘中迅速滚动，培养基环亨氏管内壁凝固，置于厌氧培养罐中37℃恒温培养48 h±2 h后计数。

1.5 数据处理

数据处理及统计分析应用SPSS17.0、One way ANOVA进行方差分析和LSD 多重比较，以P＜0.05作为差异显著性判断标准。

2 结果与分析

2.1 不同培养方式对微生物计数检出的影响

表1 不同培养方式对乳酸杆菌和双歧杆菌计数的影响（log10CFU/g鲜粪）

标准差是反应数据离散程度、精密度的一种量化形式。由表1可知，与平板涂布法和倾注平板法相比，亨氏管法用于培养乳酸杆菌和双歧杆菌对微生物计数的结果精确度好，再现性高。

2.2 不同培养方式对乳酸杆菌计数检出的影响

乳酸杆菌在MRS琼脂培养基上菌落生长特征：菌落黄白色，表面光滑，凸起，边缘整齐，不透明，质地软，湿润，直径0.6～2.7mm。

革兰氏染色：阳性。

涂片镜检：乳杆菌属菌体形态多样，呈单、双、短链或栅状排列，无芽胞。

从表1可知，采用倾注平板法计数乳酸杆菌数（对数）为11.0405，P值为0.058，即样本中变量关联有5.8%的可能是由于偶然性造成的，此方法优于平板涂布10.9798±0.099和亨氏管法的9.766±0.267。因此，乳酸杆菌适宜采用倾注平板法培养计数。

2.3 不同培养方式对双歧杆菌计数检出的影响

双歧杆菌在TPY琼脂培养基上菌落生长特征：菌落表面光滑，凸起，边缘整齐呈奶油色、瓷白色，质地柔软、细腻，不透明，直径2.1～3.5 mm。

革兰氏染色：阳性。

涂片镜检：双歧杆菌属菌体形态具有多形性，有分支呈Y、V形或棒状，标本有醋酸气味。

综合分析表1中平板涂布法、倾注平板法、亨氏管培养法检测双歧杆菌的均值、标准差、标准误及P值，亨氏管法组均值大于平板涂布法组和倾注平板法组，且其标准差和标准误都远小于其他两组，故笔者认为在本试验条件下计数双歧杆菌适宜用亨氏管法进行。

3 讨论

本试验涉及平板涂布法、倾注平板法、亨氏管培养法，3种方法的优缺点如下：

（1）平板涂布法：适用于需氧微生物的菌落观察，菌落一般在培养基表面着生，培养基是固态的，但有时菌液分布不均匀，而且涂布棒上会带走部分菌液，是计数结果小于真实结果，容易使结果产生负偏差。

（2）倾注平板法：适用于厌氧和兼性厌氧菌，不适合需氧和对热敏感的细菌培养，菌落在培养基表面和内部都会生长，培养基是液态的，操作相对麻烦。

（3）亨氏管培养法：适用于专性厌氧菌，不适合需氧和对热敏感的细菌培养，菌落在培养基表面和内部都会生长，不易染菌，培养基是液态的，操作相对简便。

乳酸杆菌（Lactobacillus）属于硬壁菌门（Firmicutes）杆菌纲（Bacilli）乳酸杆菌目（Lactobacillales）乳酸杆菌科（Lactobacillaceae），能发酵葡萄糖（或利用碳水化合物）产生大量乳酸，属兼性厌氧菌。采用涂布法培养乳酸杆菌会使或多或少的细菌受到空气中氧气的损伤而影响菌落的检测和计数，用亨氏管培养乳酸杆菌又会阻碍乳酸杆菌的有氧呼吸。本试验条件下用倾注平板法计数乳酸杆菌效果最优。

双歧杆菌是一类专性厌氧乳酸菌，但不同菌种对氧的敏感性有差异，某些菌种当有CO2存在时，对氧可以耐受[5]。亨氏管中的培养基是无菌无氧的，菌落无论在培养基表面还是内部，都能很好的生存和繁殖，有利于科学的计数双歧杆菌，提高双歧杆菌检出率的正确性。

4 结论

（1）平板涂布法、倾注平板法、亨氏管培养法用乳酸杆菌和双歧杆菌检出和计数无显著差异。

（2）乳酸杆菌适宜用倾注平板法；双歧杆菌适宜用亨氏管法。

[1]张银旺. 粪便标本中双歧杆菌定量培养方法的建立与评价[J]. 现代检验医学杂志，2005，20（6）：53-54

[2]潘灵辉. 低聚木糖对断奶仔猪生产性能、肠道菌群及免疫水平影响的研究[D].湖南：湖南农业大学， 2005

[3]赵晓静. 全营养保健代乳粉及甘露寡糖对犊牛代谢及生长发育研究究[D]. 河北：河北农业大学，2005

[4]GB 4789.35-2010.国家标准食品微生物学检验-乳酸菌检验[S]

[5]邵长玲，孙宝清，魏秋芬,等. 双歧杆菌的生理作用[J]. 中华医药杂志，2006，6（11）：1179-1181