少突胶质前体细胞的培养、鉴定及巨噬细胞移动抑制因子对其促增殖作用研究

段朝霞 张洁元 陈魁君 王建民 李兵仓

1.创伤、烧伤、复合伤国家重点实验室，重庆 400042；2.第三军医大学野战外科研究所六室，重庆 400042

少突胶质细胞是中枢神经系统的髓鞘形成细胞，它的主要功能是产生髓鞘包绕神经轴突，维持神经冲动沿轴突跳跃性传导；另外它还分泌多种神经营养因子，支持神经元的生长与存活[1]。少突胶质前体细胞（oligodendrocyte precursor cells，OPCs）是处于分化早期阶段的未成熟细胞，具有良好的增殖能力，能在体内增殖、迁移，最后分化为成熟少突胶质细胞并为髓鞘形成发挥重要作用。高纯度OPCs的制备、培养是一切研究工作的基础，目前，国内外对大鼠OPCs的培养报道很多，有关小鼠OPCs的培养方法及研究报道还比较少，本文参照国内外文献报道的新生大鼠OPCs的培养方法[2-3]，探索小鼠OPCs的培养及鉴定，并研究重组巨噬细胞移动抑制因子（rMIF）对其增殖活性的影响，为进一步深入研究其发育、分化以及移植治疗脊髓损伤等奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

高糖DMEM培养基、胎牛血清为Gibco产品，100 ×N2 添加物为Invitrogen公司产品，PDGF-AA及bFGF为Peprotech公司产品，山羊抗大鼠NG2 抗体、兔抗大鼠GFAP及MBP抗体均为BD公司产品，胰蛋白酶为Invitrogen产品，多聚赖氨酸及多聚鸟氨酸为Sigma公司产品，rMIF及拮抗剂ISO-1 为Sigma公司产品，MTT试剂盒为Sigma公司产品。倒置相差显微 镜 （Olympus）、 荧 光 显 微 镜 （Leica）、 酶 标 仪 （Thermo labsysytems）。实验动物为清洁级6～8周龄C57B6 小鼠，雌雄不限，体质量18～25g。由第三军医大学第三附属医院（所）实验动物中心提供。

1.2 混合胶质细胞的制备

实验之前，先将D-Hanks液预冷，取5～8 mL于10 cm无菌培养皿里，并将培养皿放于冰上。取新生C57B6 小鼠（生后48 h内），断颈处死后将头埋于冰中1～5min，然后浸入预冷的75%乙醇中消毒。将断头放入有预冷D-Hanks液的培养皿中清洗酒精，再将断头放入有预冷D-Hanks液的培养皿中，用镊子压住鼻部，沿图1 所示的虚线位置依次剪开新生小鼠脑皮肤、颅骨，取出脑组织，在解剖显微镜下用眼科镊依次剥除脑膜及血管，取大脑（剔除海马部分，如图1 所示）置于另一个有预冷D-Hanks液的培养皿中（1次可做5～10只新生小鼠），用眼科剪将组织剪碎，加入0.05%胰酶，用移液枪轻轻吹打几次（所有过程在冰上操作），充分混匀后，在37℃培养箱内孵育15min，期间混匀几次，然后加入含血清培养基终止消化。再用70 m细胞筛网过滤细胞悬液，将收集的细胞悬液800 r/min离心5min，弃上清液，再用D-Hanks液清洗一次细胞，加入完全培养基重悬细胞，并进行细胞计数，然后将混合细胞进行培养。

1.3 混合胶质细胞培养

将上一步制备好的细胞悬液按106/mL密度种植于75cm2的玻璃培养瓶中，放入5%CO2培养箱中培养1 h，轻轻吸出细胞悬液（以去除已贴壁的成纤维细胞）接种于预先用多聚赖氨酸处理过的75cm2的一次性细胞培养瓶中，然后将培养瓶放入37℃、5%CO2培育箱培养。第3 天半量换液，以后每3 天完全换液培养，直到9～10 d。显微镜下观察培养细胞，可见瓶底已被星形胶质细胞铺满，上层可见散在较多的小圆形折光性好的少突胶质前体细胞。

1.4 少突胶质细胞的振荡分离和差速贴壁纯化

第10 天时，将培养瓶盖拧紧，用封口膜封口，放于37℃恒温振动摇床150 r/min，震摇1 h，吸出所有培养上清，再加入新鲜培养基以去除小胶质细胞等杂细胞，然后以300 r/min速度振荡18～20 h。吸出细胞悬液加入未经多聚鸟氨酸处理的玻璃培养瓶中，60 min后吸出细胞悬液 （此步骤可除去体积较大的星形胶质细胞及成纤维细胞）放入离心管内，800 r/min离心5min，然后无血清培养液（DMEM-F12，含0.5%胎牛血清、5mL/L的 N2、10 g/L的 PDGF-AA、10 g/L的 bFGF）重悬细胞，接种于预先用多聚鸟氨酸处理过的培养瓶或培养板中，每2 d半量换液。

1.5 少突胶质细胞前体系的鉴定

每天在倒置显微镜下观察细胞的生长，待细胞长到80%融合时采用抗NG2、PDNFR、GFAP、MBP抗体进行少突胶质细胞前体系的免疫组化鉴定，同时用Hoechst33342 标记细胞核。将细胞标本用新鲜配制的4%多聚甲醛固定10 min；PBS漂洗3次，每次5min；封闭山羊血清或1%BSA室温下封闭30 min；加入大鼠抗小鼠 NG2、PDGFR、GFAP、MBP 单克隆抗体（1∶100），4℃孵育过夜或 37℃孵育 2 h，PBS 漂洗 3 次，每次5min；加入不同荧光标记的山兔抗大鼠 IgG（1∶1 000）二抗混合工作液，37℃孵育30 min，PBS漂洗3次，每次5min；再用5μg/mL的Hoechst33342 工作液室温孵育30 min，PBS漂洗3次，每次5min；最后用防止荧光淬灭的封片剂封片，荧光显微镜下随机选择九个视野，相应激发光下分别观察NG2、PDNFR、GFAP、MBP 抗体及 Hoechst33342 染色结果。

1.6 细胞增殖的测定

用甲基噻唑基四唑（MTT）试剂盒检测，严格按试剂盒说明书操作。将细胞按104/孔种植于96 孔板，待细胞70%～80%融合时加入不同浓度的MIF，继续培养48 h后，每孔加10 μL MTT试剂，轻轻混合均匀后，将培养板放于37℃孵育3 h，孵育结束后，96 孔板底部可见黑色颗粒状物质；轻轻吸掉上层液体，注意不要将黑色颗粒吸出；每孔加入100 μL颗粒溶解液，混匀后成用酶标仪在570 nm处测吸光度值。MIF用5、10、20、40、80 μg/L 5个浓度。

1.7 统计学方法

应用SPSS 11.0 软件包进行统计学处理，计量资料数据以均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 混合胶质细胞培养

细胞培养 4～5d后开始出现分层现象，下层为星形胶质细胞，细胞胞体大，培养 7～8 d，星形胶质细胞逐渐融汇连成一片，折光性弱；星形胶质细胞上面贴附着一些对称双极或三极突起的细胞，为OPCs或小胶质细胞，它们胞体小，折光性好。

2.2 OPCs的纯化与观察

150 r/min振荡1 h后，显微镜下观察发现，星形胶质细胞表层松散附着的小胶质细胞大量脱落，可见大量呈圆形或梭形，簇状聚集的OPCs，经二次振荡纯化后的OPCs胞体呈小圆形，接种到鸟氨酸处理后培养板上很快开始贴壁。2～3 d后细胞呈卵圆形、梭形或三角形，大多数具有典型的双极突起，部分为三极、多级突起（图2）。

2.3 OPCs的鉴定

纯化的OPCs培养2～3 后可做荧光免疫组化鉴定。结果显示，OPCs特异性抗原NG2 及PDGFR双抗阳性细胞占细胞总数90%以上。神经元特异性抗原MAP阴性，星形胶质细胞特异性抗原GFAP阳性细胞约占5%（图3）。

2.4 MIF对血管内皮细胞增殖的影响

MTT检测结果用吸光度OD值表示，统计结果显示，低剂量rMIF能显著促进肺少突胶质前体细胞的增殖，并具有剂量相应关系（P<0.01），而高剂量rMIF则抑制少突胶质前体细胞的增殖（P<0.01）。见表1。

表1 不同浓度重组巨噬细胞移动抑制因子对OPC增殖情况影响

3 讨论

OPCs是CNS中的一类干细胞样细胞，它能不断增殖，并最终分化为少突胶质细胞、星形胶质细胞和神经元。要弄清楚OPCs的发育、分化以及在CNS中的更多作用及机制，首先需要建立一个简便有效的离体培养方法。近年来，对于大鼠的OPCs的培养方法很多，如密度梯度法、免疫吸附法、神经干细胞定向分化培养法、振荡分离纯化法等[4-5]，但参照这些方法培养小鼠OPCs效果却不理想，并且密度梯度法操作复杂，容易引起细胞死亡，所获得的细胞纯度也低；而免疫吸附法及神经干细胞定向分化培养法的实验仪器要求高，操作过程繁琐，实验成本高。本实验参照国内外新生大鼠的培养方法及Dincman等[6]的新生小鼠OPCs的培养方法，结合实验室的具体条件，采用振荡分离及差速贴壁的纯化方法，按照Dincman等[6]的方法采用添加有 N2、PDGF-AA、bFGF的无血清培养基传代培养，结果获得了较高纯度及高密度的少突胶质前体细胞系。国外文献[7-8]报道小鼠OPCs的制备，一般采用免疫磁珠法纯化，这方法纯化OPCs成本比较大，另外由于OPCs在不同发育阶段表达的特异性标志蛋白不一样，使用免疫磁珠法纯化的OPCs数量太少。

本实验采用新生小鼠获得了较高纯度OPCs，分析原因有主要以下几方面：①所有步骤都在冰上操作，保持细胞活性。②在剥除脑膜时，应该在解剖显微镜下操作，保证脑膜及血管等组织完全剥离，这样会减少杂细胞污染。③脑膜剥离干净的脑组织尽量用眼科剪剪碎，否则组织块太大，胰酶不易消化完全，导致细胞产量低。④收集细胞时离心速率不要太高，800 r/min即可，重悬细胞时不要用移液枪反复吹打，否则影响细胞活力。⑤采用无血清培养基非常重要，既可增加OPCs的产量，也可使细胞保持未分化状态[9-10]。如果采用含血清培养基则容易分化成星型胶质细胞，表达GFAP抗原；若不添加任何成分，则细胞基本不生长，不容易存活，并容易分化成少突胶质细胞。本实验所培养细胞从形态上观察是典型的少突胶质前体细胞系；特异性抗体的免疫荧光图片显示其在整个少突胶质细胞膜及突起上均有表达，证实所培养的细胞为少突胶质祖细胞及未成熟少突胶质细胞；细胞纯化率达90%以上。

MIF是T细胞来源的一种可溶性淋巴因子，最初发现它可抑制巨噬细胞的迁移并在炎症局部活化巨噬细胞，并且它可作为垂体激素和免疫调节剂及促炎细胞因子发挥作用。在正常中枢神经系统中，能够表达于星形胶质细胞、室管膜细胞及脉络丛上皮细胞。在大鼠脊髓损伤后，脑脊液中的MIF表达迅速增加；在其他脑部疾病如中风、脑缺血缺氧等损伤过程中，MIF的表达有明显的变化[11-13]，说明MIF在脑损伤及修复过程中起着非常重要的作用。本研究初步证实，MIF可促进OPCs增殖，说明MIF在中枢神经系统疾病的发生发展中起重要作用，但其具体机制有待于进一步研究。

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