骨桥蛋白基因对大肠癌细胞增殖、侵袭及Akt磷酸化的影响

毛镇伟 朱 灵 范 钰

江苏大学附属人民医院肿瘤研究所，江苏镇江 212002

大肠癌（包括结肠癌和直肠癌）近年来在我国发病率逐年增高。由于诊疗技术限制级人群忽视，很多患者发现时即有转移。转移的方式主要有血行转移、浸润种植、淋巴结转移等，主要转移至肝脏、淋巴结、肺部、脑部、及骨等部位。如何从分子水平进行大肠癌转移机制的研究，可为干预阻断大肠癌转移提供一定的理论基础。近年发现，骨桥蛋白（osteopontinin，OPN）与许多恶性肿瘤的侵袭转移的关系具有重要的相关性[1-2]。但是目前尚不完全清楚该基因在人大肠癌细胞侵袭过程中的机制。2012年1月～2012年6月，本课题组借助于 RNA 干扰（RNA interference，RNAi）技术，以大肠癌Colo205 细胞为模型，对其采用OPN基因小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）转染处理，探讨了对癌细胞生长和侵袭的作用，并从信号转导通路（Akt）方面探讨了分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

人大肠癌细胞Colo 205 购自美国ATCC公司，本院组织细胞生物库冻存。OPN基因siRNA的正义链序列：GAA ACU CCC UGU AAA CUA A dTdT；反义链序列：UAA GUU UAC AGG GAG UUU C dTdT，由美国Dharmacon公司合成。Akt及磷酸化抗体购自美国Santa Cruz公司。其他RNA提前试剂（Trizol，RNase 抑制剂），和逆转录试剂（SSRTⅡ、Taq 酶）及转染试剂Oligofectamine购自美国Invitrogen公司。

1.2 细胞培养及转染处理

人大肠癌Colo 205 细胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640 培养液，37℃、5%CO2、 饱和湿度环境的条件下连续培养。转染前1 天，将浓度为1.0 ×105/mL的细胞接种于24 孔培养板24 h后，待细胞长满60%～70%时进行转染。细胞分组：①空白对照组（Con-A）：未经任何处理的大肠癌细胞；②脂质体对照组（Con-B）；③错配siRNA体对照组（Con-C）；④不同浓度的siRNA组：10%胎牛血清的RPMI-1640 中含不同浓度 （6.25、12.5、25.0 nmol/L）的已用脂质体包埋的siRNA。转染后于不同时间采用胰酶消化收取细胞，进行试验。

1.3 OPN基因mRNA水平检测

根据文献[3]，采用荧光实时定量RT-PCR检测OPN基因mRNA水平。

1.3.1 RNA抽提 应用Trizol抽提细胞总RNA。弃尽培养液，加入0.5mL的Trizol试剂，反复吹打，转移到1.5mL的eppendorf管中，加入0.2 mL的氯仿，振荡混匀15s，室温放置5min后,4℃条件下15000 g离心15min，吸取上清置另一新的eppendorf管中，加入0.5mL Trizol试剂体积的异丙醇，混匀后室温放置10 min，4℃条件下15000 g离心10 min，弃上清，沉淀加75%乙醇，7 500 g离心5min洗涤1次，室温放置10 min左右，加入10 μL的0.1%DEPC水溶解，260 nm测光密度，用40 μg/mLOD计算RNA浓度，用0.1%DEPC水调节浓度至 200 ng/μL，备用。

1.3.2 逆转录 取 1 μg 总 RNA， 加 1 μL oligo-dT （15mer），70℃孵育10 min，然后迅速放在冰上冷却2 min，加入以下试剂：5 ×1 st strand buffer 4 μL；0.1 mmol/L DTT 2 μL；10 mmol/L dNTP 1 μL；RNase inhibitor 1 μL；SSRTⅡ 0.5μL；H2O 0.5μL。42℃，孵育 52 min，然后 70℃ 15min。 加 80 μL 水稀释。 然后进行实时定量RT-PCR检测。

1.3.3 荧光实时定量RT-PCR实时PCR具体方法参照ABI公司的标准程序来进行。OPN引物序列为上游：5′-GGGACTTCTCAGGTCGTGTC-3′； 下 游 ：5′-AGCCCCGTACTTCTTCAGGT-3′。 FAM 探针：5'-CCGCTTCTCGTCGATGTAGGTCACG-3'-TAMRA。以3-磷酸甘油醛脱氢酶基因（GAPDH）为内参。50 μL 反应体系：OPN 基因上、下游引物各1.5μL，FAM 1 μL，GAPDH 探 针 2.5μL，2 ×PCR Mix Buffer 26 μL，cDNA 10 μL，H2O 7.5μL。 然后在进行检测，反应条件为，循环反应条件：50℃ 2 min，1 个循环；95℃ 10 min，1 个循环；95℃ 15s，60℃ 1 min。 40 个循环。

1.3.4 荧光实时定量PCR结果分析 上述反应完成后，采用△△Ct法，计算OPN基因相对于GAPDH的△Ct（△Ct=Ct GAPDH－Ct OPN），以均数±标准差（±s）表示。

1.4 软琼脂集落形成试验

癌细胞锚着不依赖性增殖采用软琼脂集落形成试验检测，具体试验方法根据文献所述[5]试验进行。

1.5 体外侵袭试验

采用Boyden小室模型方法检测。具体方法参照文献[6]所述方法进行。随机计数10个视野内的细胞数，取平均值进行统计处理，每组计数3 份样本。

1.6 癌细胞Akt磷酸化检测

转染48 h后，收集siRNA组和对照组癌细胞，以总Akt（Total-Akt）为内参照，采用常规蛋白质印迹检测各组癌细胞总 Akt及磷酸化 Akt（p-Akt）蛋白水平。

1.7 统计学方法

采用SPSS 11.5 软件对数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（±s）表示，比较采用t检验。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 siRNA转染对OPN基因表达的影响

为下调OPN基因表达水平，本研究借助于RNA干扰技术，以siRNA转染大肠癌Colo 205 细胞后，以荧光实时定量PCR方法迹检测基因mRNA水平。结果显示，与Con-A组细胞比较，不同浓度siRNA组mRNA明显下调（图1）。

图1 OPN基因siRNA转染对大肠癌细胞OPN mRNA水平的影响

2.2 软琼脂集落形成试验

本研究采用软琼脂集落形成试验观察癌细胞锚着不依赖性增殖情况。结果发现，经siRNA转染的细胞集落生长数明显减少，且呈剂量依赖性（P＜0.05）。见图2。

2.3 OPN siRNA转染对大肠癌细胞侵袭的影响

本研究Boyden 小室模型方法了解癌细胞侵袭力变化。结果发现，与Con-A组集穿过滤膜胞数比较，不同浓度siRNA组穿膜的细胞数明显减少（P＜0.05）。见图3。

2.4 siRNA转染对大肠癌细胞Akt信号通路的影响

收集转染48 h的细胞，以蛋白质印迹检测Akt磷酸化情况。如图所示，与Con-A组比较，不同浓度siRNA组Akt磷酸化水平下降，且呈浓度依赖性。见图4。

3 讨论

由于RNAi及siRNA具有高效敲除基因表达的作用，已被许多学者用来研究基因功能和基因治疗的重要工具之一。本研究针对OPN基因序列特点，设计合成siRNA，转染处理大肠癌细胞后，采用荧光实时定量PCR检测癌细胞转染效果，结果发现癌细胞OPN mRNA被抑制。说明siRNA具有明显下调OPNmRNA的效果，可以用于作为探讨在大肠癌侵袭作用中的工具。

锚着依赖性（anchorage dependence）指的是细胞须黏附于特定的细胞外基质上才能存活的特性和能力。正常真核细胞，除成熟血细胞外脱离基质将会死亡，而绝大多数肿瘤细胞在脱离基质时亦能存活，即可锚着不依赖性生长。检测锚着不依赖性增殖一般参与软琼脂形成集落培养方法。癌细胞侵袭能力强，则在软琼脂上形成的集落数目多。本课题组发现，经不同浓度的OPN siRNA转染处理后，癌细胞软琼脂形成集落数明显降低，且呈剂量依赖性。体外侵袭试验发现，经OPN基因siRNA转染处理后的大肠癌细胞侵袭细胞数显著降低，且呈浓度依赖性。由此说明，下调OPN基因表达可明显抑制大肠癌细胞的增殖和侵袭能力。

癌细胞侵袭转移过程复杂，PI3K/Akt信号通路的激活引起了广大研究学者的注意。Akt作为PI3K下游最重要的信号分子，由于和蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）和蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）高度同源，也称为蛋白激酶B（PKB）。它是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，约由480 多个氨基酸序列构成。目前发现的Akt家族成员有三种亚型：Aktl、Akt2和 Akt3，亦称为 PKBa、PKBβ、PKBγ，分别由 3 个不同基因编码[7]。Akt可被许多生长因子如血小板衍生生长因子、表皮生长因子和神经生长因子激活[8]，激活的Akt可以Caspase-9 前体蛋白和Bad而使它们失活，从而起到保护细胞作用免于凋亡[9]。许多学者研究发现，Akt信号通路激活，与癌细胞增殖及侵袭能力呈正相关[10-13]。本试验结果显示，OPN基因siRNA转染组Akt磷酸化水平明显下调，且与浓度有关。

本研究提示，抑制大肠癌细胞Akt磷酸化水平，是OPN基因调控大肠癌细胞增殖、侵袭重要机制之一。

[1] Shijubo N，Ueda T，Kon S，et al.Vascular endothelial growth factor and osteopontin in tumor biology[J].Crit Rev Oncog，2000，11（1）：135-146.

[2] Nemoto H，Rittling SR，Yoshitake H，et al.Osteopontin deficiency reduce sex perimental tumor cell metastasis to bone and soft tissues[J].J Bone Miner Res，2001，16（4）：652-659.

[3] 范钰，郑树，丁佳逸.脂质体介导的cripto反义寡核苷酸抑制结肠癌细胞端粒酶活性[J].中国病理生理杂志，2006，22（4）：761-763.

[4] Livak KJ，Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2 （-Delta Delta C （T））Method[J].Methods，2001，25（4）：402.

[5] 范钰，郑树，赵刚.青蒿琥酯对乳腺癌MCF-7 细胞抗失巢凋亡的影响[J].中国病理生理杂志，2006，22（4）：571-573.

[6] Fan Y，Zhang YL，Wu Y，et al.Inhibition of signal transducer and activator of transcription 3 expression by RNA interference suppresses invasion through inducing anoikis in human colon cancer cells[J].World J Gastroenterol，2008，14（3）：428-434.

[7] Marte BM，Downward J.PKB/Akt：connecting phosphoinositide 3-kinase to cell survival and beyond[J].Trends Biochem Sci，1997，22（9）：355-358.

[8] Hemmings BA.Akt signaling：linking membrane events to life and death decisions[J].Science，1997，275（5300）： 628-630.

[9] Cardone MH，Roy N，Stennicke HR，et al.Regulation of cell death protease caspase-9 by phosphorylation[J].Science， 1998，282（5392）：1318-1321.

[10] Sheng S，Qiao M，Pardee AB.Metastasis and AKT activation[J].J Cell Physiol，2009，218（3）：451-454.

[11] Athar M，Back JH，Kopelovich L，et al.Multiple molecular targets of resveratrol：Anti-carcinogenic mechanisms[J].Arch Biochem Biophys，2009，486（2）：95-102.

[12] Dillon RL，Muller WJ.Distinct biological roles for the akt family in mammary tumor progression[J].Cancer Res，2010，70（11）：4260-4264.

[13] Lamouille S，Derynck R.Emergence of the phosphoinositide 3-kinase-Akt-mammalian target of rapamycin axis in transforming growth factor-β-induced epithelial-mesenchymal transition [J].Cells Tissues Organs，2011，193（1-2）：8-22.