一次性力竭运动后大鼠心脏传导系统ADAMTS-1的变化及其在运动性心律失常发生中的作用

杨红霞，常 芸

一次性力竭运动后大鼠心脏传导系统ADAMTS-1的变化及其在运动性心律失常发生中的作用

杨红霞，常 芸

目的：探讨力竭运动后不同时相心脏窦房结、房室结和浦肯野氏纤维细胞炎性因子

金属蛋白酶-1基因和蛋白水平的表达特点，为运动性心律失常发生机制的阐明提供实验依据。方法：100只健康成年雄性SD大鼠随机分为一次力竭运动、反复力竭组及相应的其对照组，每组10只。分别于力竭运动后0 h、4 h、12 h及24 h取材，进行心电图、免疫荧光组化及实时荧光定量PCR分析。应用激光显微切割技术定位并收集房室结和浦肯野氏纤维细胞研究细胞炎性因子ADAMTS-1的mRNA和蛋白表达的变化。结果：一次力竭运动后房室结和浦肯野氏纤维炎性反应相关因子ADAMTS-1mRNA和蛋白即刻显著高于对照组（P＜0.05）。运动后即刻窦房结、房室结、浦肯野氏纤维ADAMTS-1基因与蛋白表达明显上升，之后开始下降，4 h接近低谷，一直持续到24 h（P＜0.05），以浦肯野氏纤维的蛋白改变更为显著（P＜0.01）。结论：一次力竭运动后心脏传导系统各部位炎性因子ADAMTS-1在mRNA和

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蛋白水平大量表达，引起传导系统炎性细胞浸润，细胞间质增殖乃至纤维化，是运动性心律失常的诱发因素之一。一次力竭运动后心脏传导系统ADAMTS-1蛋白的表达以浦肯野氏纤维的改变更为明显，易影响正常心律的室内传导，构成运动性室性心律失常的发生基础。

力竭运动；金属蛋白酶-1；心脏传导系统

随着竞技体育比赛的日益激烈，运动性心律失常的发生也日渐显著，成为运动医学领域十分关注的医学问题。早年运动医学界曾对此进行了广泛的临床观察与调研[1]。但由于其病理过程与发生机制是一个极其复杂的过程，涉及众多因子，因此，成为该研究领域的难点与热点。常芸研究团队针对运动性心律失常的病理与发生机制进行了大量实验性研究[2-3]。鉴于以往实验性研究方法的限制，多数集中在心肌组织，很难概括心律失常发生的病理机制，因而目前运动性心律失常发生的病理过程与机制仍未完全明了。心脏传导系统作为心电活动的控制中心和冲动传导的重要部位，其特殊的组织结构和细胞类型决定其具有不同于普通心肌的心电起搏和传导功能，与各种类型心律失常的发生和发展有密切关系，因此有必要展开心脏传导系统的研究。

金属蛋白酶（ADAMTS）是新近发现的具有蛋白质水解功能的金属蛋白酶家族，属于分泌型蛋白，可由巨噬细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞等多种细胞合成和分泌[8]，分泌后大多通过C末端3个TSP重复序列和间隔区锚定在细胞外基质（ECM）中，并与之结合从而参与ECM蛋白的调节[9、10]。有研究表明，ADAMTS-1参与动脉粥样硬化的病理过程与ECM重构关系密切，具有降解I型胶原的作用[11]。ADAMTS-1可能通过调节胶原代谢而参与心肌纤维化的发生发展过程, ADAMTS-1与CVB3感染所致病毒性心脏病心肌纤维化关系密切[13]。TNF-a可以诱导内皮细胞表达ADAMTS-1，从而分泌到细胞外基质并与之结合，参与细胞外基质蛋白的调节，降解蛋白多糖，聚集蛋白聚糖、多能聚糖以及胶原蛋白[16]，引起心肌组织局部肌肉间隙增宽，导致心肌组织结构改变，最终影响心功能。在运动条件下心肌细胞中ADAMTS-1的改变还未见研究报道。

利用SDS2.2软件对实时定量PCR数据进行分析处理，并导出文件及图像。利用管家基因对目的基因的表达进行校正，得到相对定量结果（相对数值）。结果用平均数±标准差表示，组间比较采用多因素方差分析，显著性水平为P＜0.05。

1 材料与方法

1.1 实验对象

表14所示为不同方法优化结果的比较。其中，序列采样方法的初始采样准则为继承拉丁超立方采样(样本集大小为45)。可以看出，相较于序列采样方法，一次采样方法LHS方法所用样本较多，最优解处精度较低;局部序列采样方法(LAS方法和LMPP方法)和全局序列采样方法(EGRA方法和IBS方法)都能够获得较为准确的最优解，但局部采样方法更加高效准确。所有方法中，本文方法相对误差和样本数最小。

健康雄性成年SD大鼠100只，8周龄，体重(22.0±8) g。国家标准啮齿动物饲料喂养，自由饮食。饲养环境为室温（20±2）℃，光照时间12 h，相对湿度40%～55%。

（1）沟通高效性。BIM技术应用于建筑工程项目管理中，能够基于建筑工程项目模拟出具体的项目3D模型，通过BIM技术的应用实现了建筑项目从设计、施工、运营及管理的全生命周期的可视化，能够便于建筑工程的施工方、业主单位以及分包商基于项目可视化，保障各方的充分、有效地沟通，减少因信息交流不畅而导致的建筑工程质量问题，使建筑工程项目符合各方要求。

将100只实验大鼠随机分为10组，每组10只。其中一次力竭和2周反复力竭游泳运动[5]各4组，相应安静对照2组。安静对照组不运动，力竭运动各组大鼠尾部负重为体重的3%，每周运动6天，每天1次。力竭标准参照Thomas的报道[6]即：“经过10 s后动物仍不能返回水面，并且捞出后置于平面不能完成翻正反射。”

1.3 取材

最后一次力竭运动后即刻、4 h、12 h及24 h等不同时相取材，迅速取出心脏，沿心脏矢状面的方向将整个心脏用OCT包埋，液氮骤冷，作全心连续冰冻切片，光镜定位心脏传导系统，运用激光显微切割仪切割分别收集窦房结细胞或细胞团[7]。

1.4 实时荧光定量PCR检测

2.2 心脏传导系统ADAMTS-1mRNA表达结果

除了吃草，婆婆家的山羊还时常吃点好东西——山芋啊、花生啊、黄豆啊……婆婆的精心照料，让小山羊长得膘肥体壮，一身白毛油光水滑。

表1 PCR引物序列TableⅠ PCR Primer Sequence

一次力竭运动后部分大鼠出现心律失常，心脏肉眼观察有不同程度的充血，且反复力竭游泳运动后各时相组心脏重量指数均显著高于对照组心脏重量指数（P＜0.05）[17]。

心脏传导系统冰冻切片进行免疫荧光组织化学染色，采用Leica AD MDW活细胞多维图成像工作站和Leica Qwin图像分析系统对目标因子蛋白荧光强度进行定量，荧光强度用积分灰度表示（IOD），参考阴性对照标本中荧光强度，灰度值在40～130之间为蛋白阳性表达。

1.6 统计学分析

为此，本研究对力竭运动后心脏传导系统的ADAMTS-1表达变化进行研究，试图为运动性心律失常发生机制的阐释提供实验依据。

2 结果

2.1 心脏传导系统一般指标

1.5 免疫荧光检测

1.2 运动负荷

采用Trizol法提取总RNA，并逆转录cDNA，存于-20℃备用。通过互联网搜索Genbank查找目标因子结蛋白和内参照β-actin的引物基因序列，应用Primer 5软件进行引物设计，引物扩增目标基因片断长度均小于150 bp，其PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测验证引物可用后，再进行荧光定量PCR，取定量PCR用 96孔板，加入cDNA和引物配置25μ L反应体系。实时定量RT-PCR主要过程：预变性95℃ 30 s，PCR反应95℃10 s，60℃ 30 s，40个循环。检测CT值（见表1）。设计的引物由上海生工生物技术有限公司合成。

如表2所示，经一次力竭游泳运动后即刻心脏传导系统各部位ADAMTS-1基因mRNA表有所增高，随后，4 h、12 h、24 h心脏传导系统窦房结ADAMTS-1mRNA表达均显著低于对照组（P＜0.05）和即刻（P＜0.05）。

一次力竭游泳运动后即刻房室结ADAMTS-1mRNA表达显著高于对照组（P＜0.01），4 h、12 h、24 h均显著低于对照组和即刻（P＜0.01）。

分析数据可能存在量纲不同的情况，如体重和身高，它们量纲不同，体重可能在40-60kg间，身高可能在140-170cm之间，那么就需要进行数据标准化处理。若直接用原数据分析，可能会加强数值较高的指标在分析结果的作用，削弱数值较低的指标在分析结果的作用。数据标准化公式：

一次力竭游泳运动后12 h浦肯野氏纤维显著低于对照组和4 h（P＜0.05）。各时相心脏传导系统部位之间差异不明显（P＞0.05）。

一次力竭运动后心脏传导系统各部位ADAMTS-1基因mRNA表达呈时相性规律，一次力竭运动后即刻窦房结、房室结、浦肯野氏纤维ADAMTS-1基因mRNA表达明显上升，之后开始下降，到力竭后4 h下降接近低谷，一直持续到24 h，其中浦肯野氏纤维的改变更为明显（见图1）。

表2 一次力竭运动后大鼠ADAMTS-1mRNA相对表达量TableⅡ Relative Expression Quantity of Rat ADAMTS-1mRNA after One-time Exhaustive Exercise

2.3 心脏传导系统ADAMTS-1蛋白表达结果

心脏传导系统不同部位在一次力竭游泳运动后存有差异。其中即刻，房室结ADAMTS-1蛋白表达显著低于窦房结和浦肯野氏纤维（P＜0.01），窦房结又显著低于浦肯野氏纤维（P＜0.01）。4 h，窦房结显著高于房室结和浦肯野氏纤维（P＜0.01）。12 h，浦肯野氏纤维显著低于窦房结和房室结（P＜0.01）。

如表3所示，经一次力竭游泳运动后，心脏传导系统窦房结、房室结、浦肯野氏纤维ADAMTS-1蛋白表达即刻显著高于对照组（P＜0.01），4 h、12 h、24 h又均显著低于对照组和即刻（P＜0.01）。

表3 反复力竭运动后大鼠ADAMT S-1蛋白表达总灰度值变化情况TableⅢ Changes of Total Gray Value of Rat ADAMTS-1 Protein Expression after One-time Exhaustive Exercise

一次力竭运动后心脏传导系统各部位ADAMTS-1基因蛋白表达呈时相性规律，一次力竭运动后即刻窦房结、房室结、浦肯野氏纤维ADAMTS-1基因蛋白表达明显上升，之后开始下降，到力竭后4 h下降接近低谷，一直持续到24 h，其中，浦肯野氏纤维的改变更为明显（见图2）。

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3 讨论

ADAMTS是新近发现的具有蛋白质水解功能的金属蛋白酶家族，I型血小板结合蛋白基序（TSP）的解聚蛋白样金属蛋白酶（ADAMTS-1）是ADAMTS家族成员，属于分泌型蛋白，可由巨噬细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞等多种细胞合成和分泌[8]，分泌后大多通过C末端3个TSP重复序列和间隔区锚定在细胞外基质（ECM）中，并与之结合从而参与E C M蛋白的调节[9、10]。有研究表明，ADAMTS-1参与动脉粥样硬化的病理过程与ECM重构关系密切，具有降解I型胶原的作用[11]。申锷，陈瑞珍等[12]研究表明ADAMTS-1可能通过调节胶原代谢而参与心肌纤维化的发生发展过程。也有学者观察柯萨奇病毒B组病毒感染小鼠引起急、慢性病毒心肌炎心肌A D A M T S-1表达发现，ADAMTS-1与CVB3感染所致病毒性心脏病心肌纤维化关系密切[13]。在运动条件下心肌ADAMTS-1的变化还未见报道。

研究大鼠急性心肌梗死（AMI）ADAMTS-1的表达发现，结扎后6 h，ADAMTS-1mRNA的表达到高峰，在ADAMTS-1表达高的区域出现心肌坏死，提示ADAMTS-1表达高的区域，心肌损害程度越严重。本研究发现，一次力竭运动后即刻房室结ADAMTS-1mRNA表达呈现先升高后下降的趋势。即刻显著高于对照组和其它各运动组，之后各时相出现下降，且4 h、12 h、24 h组又均显著低于对照组和即刻。由于ADAMTS-1具有降解细胞外基质的功能，能破坏细胞结构，使酶活性丧失，糖蛋白分解，细胞功能的损坏，导致心肌细胞的凋亡或坏死，一次力竭运动后ADAMTS-1表达的升高，可以导致细胞坏死，尤其一次力竭运动对房室结细胞炎性刺激较为严重，细胞损害程度更大，更易诱发运动性心律失常的发生。

研究发现[15]，TNF-a可以诱导内皮细胞表达ADAMTS-1，从而分泌到细胞外基质并与之结合,参与细胞外基质蛋白的调节，降解蛋白多糖，聚集蛋白聚糖、多能聚糖以及胶原蛋白[16]，引起心肌组织局部肌肉间隙增宽，导致心肌组织结构改变，最终影响心功能。本研究发现，一次力竭运动后浦肯野氏纤维ADAMTS-1mRNA和表达呈现先上升后下降的趋势，且运动后12 h显著低于对照组和4 h。一次力竭运动后浦肯野氏纤维ADAMTS-1表达的升高，可降解细胞外基质的功能，破坏细胞结构，使酶活性丧失，糖蛋白分解，细胞功能的损坏，导致细胞的凋亡或坏死，从而进一步引发心律失常。综上，一次力竭运动后，心脏浦肯野氏纤维ADAMTS-1mRNA和蛋白表达均出现不同程度升高，引起浦肯野氏纤维出现炎症反应，使浦肯野氏纤维结构和功能受损，影响正常心律的室内传导，构成运动性室性心律失常的发生基础。

4 小结

4.1 一次力竭运动后窦房结、房室结和浦肯野氏纤维炎性反应相关因子ADAMTS-1mRNA和蛋白即刻显著增高，可诱导炎性因子大量表达，引起传导系统炎性细胞浸润，细胞间质增殖乃至纤维化，构成运动性心律失常的诱发因素之一。

目前，中国成品油批发价格已经基本实现完全市场化，但零售价格仍参照国家规定的最高零售限价来确定，尚未实现完全市场化，无法有效反映国内成品油市场供需现状。过高的批发价与零售价价差使得一些炼油企业容易误判国内成品油市场供需形势，导致部分地区和企业盲目扩张炼油能力，进一步加剧了中国成品油供应过剩的局面。建议国家加快推进成品油定价机制向市场化定价迈进，以真正有效反映国内成品油市场的供需状况。另外，加快推出成品油期货交易，为市场化定价提供定价基准。通过推动成品油价格市场化，实现资源的最优配置。

4.2 一次力竭运动后心脏传导系统各部位ADAMTS-1基因与蛋白表达呈时相性规律，运动后即刻窦房结、房室结、浦肯野氏纤维ADAMTS-1基因与蛋白表达明显上升，之后开始下降，4 h接近低谷一直持续到24 h。

4.3 一次力竭运动后心脏传导系统ADAMTS-1蛋白的表达以浦肯野氏纤维的改变更为明显，易影响正常心律的室内传导，构成运动性室性心律失常的发生基础。

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(责任编辑：何聪)

Changes of Rat Heart Conduction System ADAMTS-1 and It's Function in the Occurrence of Athletic Arrhythmia after One-time Exhaustive Exercise

YANG Hong-xia, CHANG Yun
(China Institute of Sport Science, Beijing 100061, China)

Objective To explore the expression characteristics of sinoatrial node, atrioventricular node, Purkinye's fibre cell inflammatory factor MMP-1 gene and protein levels after exhaustive exercise so as to provide experimental reference to the occurrence mechanism of athletic arrhythmia. Method 100 healthy adult male SD rats were divided randomly into groups of one-time exhaustive exercise groups, repeated exhaustive groups and relative control groups. Each group has 10 rats. Samples were collected immediately, 4 hours, 12 hours and 24 hours after the exhaustive exercise.Electrocardiogram, immunofluorescence and real-time fluorescent quantitative PCR analysis were adopted. Using fibre laser cutting technology to position and collect the changes of mRNA and protein expression of atrioventricular node and Purkinye's fibre cell inflammatory factor ADAMTS-1. Result The immediate samples of mRNA and protein of atrioventricular node and Purkinye's fibre inflammatory factor ADAMTS-1 after one-time exhaustive exercise are significantly higher than those of the control group (P<0.05). Sinoatrial node, atrioventricular node and Purkinye's fibre ADAMTS-1 gene and protein expression rose distinctly immediately after the exercise, and then starts decreasing. After 4 hours, the indicators drop nearly to the bottom and continue until 24 hours (P<0.05). The changes of Purkinye's fibre protein are quite obvious (P<0.01). Conclusion Large quantity of mRNA and protein expression of the different parts inflammatory factor ADAMTS-1 of heart conduction system after one-time exhaustive exercise causes infiltration of the inflammatory cell of the conduction system, proliferation of intercellular substances and fibrosis. This is one of the risk factors for athletic arrhythmia. After one-time exhaustive exercise, clear changes of Purkinye's fibre protein can be seen in the protein expression of heart conduction system ADAMTS-1. This may affect intraventricular conduction of normal heart rhythm and form a base for athletic arrhythmia.

exhaustive exercise; MMP-1; heart conduction system

G804.5

A

1006-1207(2012)04-0017-04

2012-06-27

国家体育总局体育科学研究所基本科研业务经费（10-01）

杨红霞，女，研究生. 主要研究方向：运动心脏病理与医学监督.

国家体育总局体育科学研究所，北京体育馆路11号，北京100061