番茄Cf-5基因的SNP分子标记开发

张育垚，李景富，谢立波，张 贺，康立功，姜景彬，许向阳

（东北农业大学园艺学院，哈尔滨 150030）

番茄叶霉病是危害保护地番茄生产的重要病害之一，是一种世界性的病害，可导致番茄产量下降，直接影响番茄生产的经济效益。英国于1883年首次报道了番茄叶霉病的发生[1]，自此以后，世界各国科学家展开了对番茄叶霉病的研究。随着番茄保护地种植面积的不断扩大，保护地内特殊的环境条件造成的番茄叶霉病病害也日趋严重，因而，番茄叶霉病受到植病专家和育种专家的广泛关注。

防治番茄叶霉病最有效的方法就是培育抗病品种。美国、加拿大从20世纪30年代开始进行抗病品种的选育，日本从60年代开始相关研究，70年代就已育成近60个抗叶霉病品种。而我国的番茄抗叶霉病育种开始于上世纪80年代。上个世纪70、80年代已经在荷兰、法国等地发现了侵染Cf-5和Cf-9基因的番茄菌株[2-3]，但是尽管如此，国外新育成的抗病品种仍然以Cf-5和Cf-9基因为主。我国主要育种单位先后培育出如中杂9号、佳粉15号和浙粉202等一系列抗病品种[4]，其中佳粉15号一代杂种，含有两个抗叶霉病基因（Cf-4、Cf-5）。利用具较高抗性的Cf-5基因也将是我国叶霉病抗病育种的重要目标之一。

依靠常规的方法培育抗病品种困难很大，这是由于人为的鉴定标准存在差异，在一定程度上造成了鉴定结果的不准确性，同时在鉴定过程中要耗费大量的人力和物力，延长了育种周期，经过较长时间培育的抗病品种很可能在推广时就己经成为非抗病品种。因此，利用分子标记辅助选择育种成为了有效控制番茄叶霉病的一条新途径。

单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphisms，SNP）是指同一物种不同亚种、变种以及不同个体间由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，目前它已作为新一代分子标记，在分子遗传学研究中发挥着重要作用。在植物分子生物学研究中，SNPs标记已受到各国学者的高度重视，现已在水稻[5-6]、小麦[7]的亚种间以及向日葵[8]、玉米[9]、木薯[10]等粮食和经济作物中开展了SNP研究。利用SNP对番茄进行辅助育种为有效控制番茄叶霉病提供了一条新途径。本研究以4份抗病材料和4份感病材料为试材，以Cf-5基因为研究对象，开发Cf-5基因的SNP标记，为番茄叶霉病抗病基因Cf-5的分子标记辅助育种奠定良好的基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试的番茄材料均由东北农业大学园艺学院番茄课题组提供。

番茄叶霉病抗病品种编号：06831、06832、06885、09876；

番茄叶霉病感病品种编号：06905、06907、06914、06919。

1.2 方法

1.2.1 番茄叶霉病抗性苗期接种鉴定

取保存的番茄叶霉病菌1.2.3.4，用蒸馏水洗成孢子悬浮液，孢子浓度为每毫升1×107个孢子，接种前24 h对接种植株进行保湿，次日傍晚对待检测番茄材料进行喷雾接种。18 d后开始根据叶片病斑情况进行调查。

1.2.2 DNA的提取

当番茄植株长至2～3叶期时，进行叶片的采摘，采摘后用自来水及蒸馏水清洗两遍，保证提取的DNA有较高的质量。将试验材料各单株的叶片分装到1.5 mL离心管中，每管约为0.1 g，写清编号，用液氮速冻后备用。采用CTAB法对番茄材料进行DNA的提取[11]。

用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA是否降解，用紫外分光光度计测定DNA在OD260和OD280下的吸光值，所有材料OD260/OD280均在1.7～1.9之间，表明DNA质量很好。

1.2.3 引物设计

综合Primer primer 5和Oligo6软件，以Cf-5基因为模板设计3对嵌套引物，采用高保真的Pfu DNA聚合酶（美国MBI公司）进行PCR，扩增抗感番茄材料的Cf-5基因序列。引物如表1所示。

表1 引物序列及信息Table1 Sequence and information of the primers

1.2.4 PCR扩增

PCR反应体系（50 μL）：35.5 μL ddH2O，5 μL 10×Pfu Buffer，5 μL dNTP，1 μL上游引物，1 μL下游引物，2μL模板DNA，0.5μLPfuDNA聚合酶。

热循环程序：95℃预变性3 min，（95℃变性30 s、Tm-5℃退火30 s、72℃延伸2 min）×35个循环，72℃终延伸10 min，4℃保存。

1.2.5 测序及序列比对，查找SNP位点

测序由北京六合华大基因科技股份有限公司和上海生工生物工程技术服务有限公司共同完成。用DNAStar软件系统的Editseq、Seqman、MegAlign软件包分析已测序列，获得基因序列特异的差异。

1.2.6 SNP检测

针对SNP位点，设计特异引物。本试验针对580 bp T-C转换和2 879 bp处的G-T颠换筛选出6个引物，其中，T-C转换中，T1为T13、T14的互补引物；G-T颠换中，T2为T18、T19的互补引物。以抗感番茄材料DNA为模板进行AS-PCR扩增，ASPCR反应体系（20 μL）：10×Buffer 2 μL，上下游引物各1 μL，Mg2+2 μL，dNTP 1 μL，DNA模板1 μL，Taq酶0.2 μL。反应程序为：94℃预变性5 min，（94℃变性45 s、Tm-5℃退火45 s、72℃延伸1 min）×35个循环，72℃终延伸10 min，4℃保存。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增结果

以8个含有Cf-5基因的番茄抗感材料总基因组DNA为模板，用本研究设计并合成的三对嵌套引物进行PCR扩增，可以扩增出片段长度分别为1 936、1 542和769 bp。

由图1可以看出，在所有8份材料中均扩增出了与目的基因序列长度相符的基因片段，表明引物设计及扩增程序是可行的，所扩增的片段应该是Cf-5基因或其等位基因的单拷贝片段。

图1 PCR扩增产物的电泳检测Fig.1 Detection of PCR product

2.2 生物学信息比对结果

试验通过对NCBI上公布的Cf-5基因序列以及抗病材料06885、06831、06832、09876，感病材料06905、06907、06914、06919的扩增产物进行了多态性分析。得到两个SNP突变（S580-T→C，S2879-G→T），如图2所示。

图2 样本的突变位点Fig.2 Mutation sites of the samples

2.3 等位基因PCR引物设计与筛选

为了获得理想的特异条带，我们在试验中分别在引物3'端的第2、3个碱基位置引入错配碱基，并检测它们的扩增情况。试验中以06885和06919为材料进行引物的筛选，通过筛选，确定T1、T2、T13、T14、T18、T19为等位基因特异引物。引物T1、T13、T14为针对580 bp处SNP位点设计的互补引物，其中T1为正义链通用引物，T13为3'端与SNP突变基因型相匹配的反义链引物，T14的3'端则与SNP位点基因型不匹配，同时，在T13、T14的3'端第二位均引入A/G碱基错配；引物T2、T18、T19为针对2 879 bp处SNP位点设计的互补引物，其中T2为正义链通用引物，T18为3'端与SNP突变基因型相匹配的反义链引物，T19的3'端则与SNP位点基因型不匹配，同时，在T18、T19的3'端第二位也均引入A/G强错配碱基，结果显示，T13、T18仅在06919中有特异条带，在06885中无条带，T14、T19仅在06885中有特异条带，而在06919中无条带（见图3）。由此可以判断，T1、T2、T13、T14、T18、T19引物特异性良好，为种质资源抗叶霉病筛选奠定了良好的基础。

图3 与SNP位点匹配的等位基因特异引物扩增Fig.3 Allele-specific primer amplification on the SNP site

2.4 SNP分子标记的获得

通过将NCBI上公布的番茄抗叶霉病基因Cf-5基因与抗病材料和感病材料中Cf-5基因进行序列比对，以及以06885和06919为亲本的F2群体对两对引物的相互筛选验证，我们得到了稳定的等位基因特异引物T14和T19，它们在抗病材料06885和感病材料06919之间获得了稳定的差异（见图3），并且在F2群体的分型的带型检测中获得了稳定的遗传多样性。

3 讨论与结论

试验中应用前人总结出的等位基因设计原理针对以上突变位点设计大量的等位基因特异PCR引物，以期获得理想的PCR效果。通常认为，引物3'末端碱基与模板互补才会在适合的条件下发生延伸，否则不能延伸。但是，在实际应用中，3'末端单个碱基的错配通常不能阻止扩增延伸，因此，Ye等的研究认为[12]，在特异引物3'端1、2位加入错配碱基就可以获得较好的差异产物，且C/T与G/A错配为强的碱基错配类型；A/A、C/C、G/G、T/T为中等的碱基错配类型；C/A和G/T为弱的碱基错配类型。因此，在特异引物3'末端错配碱基的搭配上采取强弱搭配，或者中中搭配，获得理想扩增效果的可能性较大。

目前，分子标记辅助选择已成为农作物分子育种的关键技术，国内番茄抗病育种在基因工程方面主要应用的技术有RAPD、AFLP、微卫星技术等第一代、第二代分子标记[13-15]，SNPs作为继第一代、第二代分子标记后的第三代分子标记，具有密度高，多态性丰富，高度遗传稳定性等优点，同时，SNP是一种二态的标记，易于分型，有利于快速的，自动化的筛选和检测以及批量规模的筛选和分析[16]，因此，SNP标记具有新一代分子标记所特有的意义和价值，在分子标记辅助选择育种中具有广阔的应用前景。

本研究的等位基因特异引物设计，结合前人的研究成果，首选第2、3位引入强错配碱基以及低2、3位中强错配碱基搭配的方法，获得较好的差异扩增，节约了试验成本。

番茄抗叶霉病基因Cf-5基因的相关研究早有报道。van Wordrege等利用携带L.pennllii染色体6的置换体系“WSL6”（Substitution line），并结合缺失作图对分离世代进行了分子标记作图分析，发现Cf-2/Cf-5座位和Mi基因与SCAR标记REX-1紧密连锁[17]。1993年，Cf-5基因的成功克隆为本研究的SNP标记的开发奠定了基础[17]。本研究利用已知的Cf-5基因序列创制分子标记，所开发的SNP标记具有一定的稳定性与可靠性，这将为番茄抗叶霉病基因Cf-5基因的分子标记辅助育种提供有效的选择手段。

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