饲喂方式和饲粮色氨酸水平对扬州鹅免疫功能及抗氧化指标的影响

魏宗友 王洪荣 潘晓花 喻礼怀 季 昀

(1.扬州大学动物科学与技术学院，扬州 222500;2.太仓市畜牧兽医站，太仓 215400)

色氨酸(tryptophan，Trp)作为动物体内不可缺少的营养成分，近年来引起学者的广泛关注。除了作为底物合成蛋白质以外，色氨酸还具有多种生理功能，如调节动物的采食量和增强机体免疫功能等[1-5]。饲粮中色氨酸缺乏，不仅造成动物机体营养水平和免疫功能的下降，同时增加了动物对疾病的易感性及感染性疾病的发病率和死亡率。研究发现，色氨酸作为免疫相关蛋白的限制性氨基酸，直接调节动物的体液免疫。一般情况下，色氨酸缺乏会影响血清中免疫球蛋白的合成，从而使得机体的免疫功能降低，适当补充色氨酸有利于增强动物的体液免疫[1，5]。目前，国内外有关色氨酸调节免疫机能的研究主要在鼠、猪等哺乳动物及肉鸡上，而在水禽鹅方面还未见报道，同时研究过于强调色氨酸本身的作用，而忽视了调控采食量这一重要的因素。因此，本试验以扬州鹅为试验动物，探讨饲喂方式和饲粮色氨酸水平对扬州鹅免疫功能及抗氧化指标的影响，这对于更深入地研究色氨酸调节免疫功能的作用机理具有十分重要的意义。

1 材料与方法

1.1 试验动物与饲养管理

选取同一批出雏、体质健壮、体重接近、饲养管理一致的3周龄扬州公鹅270只，随机分成6组，每组3个重复，每个重复15只鹅。试验鹅从基础饲粮经过7 d过渡(22～24日龄，试验饲粮替换1/3基础饲粮;25～26日龄，试验饲粮替换1/2基础饲料;27～28日龄，试验饲粮替换2/3基础饲料)为正式试验饲粮，5周龄开始正式试验，试验期42 d。供试雏鹅采用舍内地面平养，自由饮水，控制舍内温度、湿度、光照，定期清洁鹅舍及周围环境，其他饲养管理以及有关免疫程序、卫生消毒、定期驱虫等按照常规方法进行。

1.2 试验设计

试验采用2×3二因子完全随机设计，饲喂方式分为自由采食和限制饲喂，限制饲喂组鹅饲粮供给量为前1天自由采食组饲粮消耗量的90%。在总结长期生产经验的基础上，参考现有关于鹅营养需要量的有关资料[6-7]以及 NRC(1994)标准，试验饲粮色氨酸设3个水平，在基础饲粮中分别以低、中、高3个水平添加L-色氨酸(L-Trp，纯度为99%，德固赛)，添加水平分别为0、0.08%和0.16%，最终使得各组饲粮中色氨酸水平分别为0.14%、0.22%和0.30%。基础饲粮组成及营养水平见表1。

1.3 测定指标与方法

1.3.1 生长性能

在第10周早上对扬州鹅逐只空腹称重(停饲12 h后)，以重复为单位记录试验鹅的平均日采食量(ADFI)，并计算平均日增重(ADG)和料重比(F/G)。

1.3.2 免疫器官指数

在第10周早上，分别从各重复中随机选取3只鹅进行屠宰，取脾脏、胸腺和法氏囊。免疫器官指数按下式计算:

脾脏指数(g/kg)=脾脏重/活体重;

胸腺指数(g/kg)=胸腺重/活体重;法氏囊指数(g/kg)=法氏囊重/活体重。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)Table1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

1.3.3 抗氧化指标

在第10周早上，分别从各重复中随机取3只鹅进行屠宰。采血前禁食12 h，采血后静置2 h，以3 000 r/min离心15 min，将析出的血清于-20℃保存备测。血清总抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)以及谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性和丙二醛(malonaldehyde，MDA)含量采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒测定。

1.3.4 免疫指标

血清免疫球蛋白A(immunoglobulin A，IgA)、免疫球蛋白 G(immunoglobulin G，IgG)和免疫球蛋白M(immunoglobulin M，IgM)含量采用免疫比浊法测定。

1.3.5 组织超微结构检测

在第10周屠宰后，取脾脏组织，切成1 mm3的小块，置于2.5%戊二醛中固定保存。在做切片之前，先将之前固定的脾脏样品用磷酸缓冲液清洗3次，再用1%锇酸固定，经过磷酸缓冲液冲洗3次，50%、70%、90%、100%无水乙醇，100%丙酮以及添加了无水Na2SO4的100%丙酮逐级脱水，无水丙酮与包埋剂按1∶1、1∶2的体积比混合渗透，纯包埋剂渗透、包埋、聚合、修块，超薄切片(超薄切片机，Leisa，Germany，型号:EMUC-6)，经醋酸铀、枸橼酸铅双重染色，自然干燥后置于Tecnai-12型透视电子显微镜(Philips company，Holland)观察病理组织学超微结构变化并拍照。

1.4 统计分析

试验数据用Excel 2003建立数据库，通过SAS 9.1.3软件中的ANOVA模块进行两因素方差分析，运用Duncan氏法进行多重比较，P＜0.05为差异显著，结果以平均值±标准差表示。统计分析模型为:

式中:Yij为性状测定值;μ为群体均值;Ii为饲喂方式效应;Dj为色氨酸效应;(ID)ij为饲喂方式和色氨酸水平因素的交互效应;Eij为随机误差效应。

2 结果

2.1 饲喂方式和饲粮色氨酸水平对扬州鹅生长性能的影响

由表2可知，自由采食组扬州鹅 ADFI和ADG显著高于限制饲喂组(P＜0.05)，而饲喂方式对F/G无显著影响(P＞0.05)。与低、高色氨酸水平组相比，中色氨酸水平组扬州鹅ADFI显著提高了5.17%和3.91%(P＜0.05)，ADG显著增加(P＜0.05)，但是色氨酸水平对F/G无显著影响(P＞0.05)。饲喂方式和色氨酸水平对扬州鹅ADFI和ADG有显著的交互作用(P＜0.05)，而对F/G无显著的交互作用(P＞0.05)。

2.2 饲喂方式和饲粮色氨酸水平对扬州鹅免疫器官指数的影响

由表3可知，饲喂方式对扬州鹅脾脏指数、胸腺指数和法氏囊指数无显著影响(P＞0.05)。与低色氨酸水平组相比，高色氨酸水平组扬州鹅脾脏指数显著增加了15.73%(P＜0.05)，中色氨酸水平组脾脏指数有增加的趋势，但是与其他2组差异不显著(P＞0.05)。饲粮色氨酸水平对扬州鹅胸腺指数和法氏囊指数无显著影响(P＞0.05)。饲喂方式和色氨酸水平对扬州鹅免疫器官指数无显著的交互作用(P＞0.05)。

2.3 饲喂方式和饲粮色氨酸水平对扬州鹅血清免疫球蛋白含量及抗氧化指标的影响

由表4可知，自由采食组扬州鹅血清IgA和IgG含量高于限制饲喂组，血清IgM含量低于限制饲喂组，但差异不显著(P＞0.05)。随着饲粮色氨酸水平的增加，血清IgG和IgM含量呈不同程度的上升，与低色氨酸水平组相比，中、高色氨酸水平组血清IgG含量分别显著增加了29.88%和43.68%(P＜0.05)，高色氨酸水平组血清IgM含量比低色氨酸水平组显著增加了37.70%(P＜0.05)。饲粮色氨酸水平对血清IgA含量无显著影响(P＞0.05)。饲喂方式和色氨酸水平对血清IgG和IgM含量有显著的交互作用(P＞0.05)。

由表5可知，自由采食组扬州鹅血清T-AOC显著高于限制饲喂组(P＜0.05)，饲喂方式对血清MDA含量及SOD、GSH-Px活性无显著影响(P＞0.05)。随着饲粮色氨酸水平的增加，中、高色氨酸水平组扬州鹅血清SOD活性和T-AOC显著增加(P＜0.05)，与低色氨酸水平组相比，中、高色氨酸水平组血清SOD活性分别显著增加了9.32%和9.22%(P＜0.05)，血清T-AOC分别显著增加17.64%和15.36%(P＜0.05)。饲粮色氨酸水平对血清MDA含量和GSH-Px活性无显著影响(P＞0.05)。饲喂方式和色氨酸水平对血清抗氧化指标无显著的交互作用(P＞0.05)。

表2 饲喂方式和饲粮色氨酸水平对扬州鹅生长性能的影响Table2 Effects of feeding regimen and dietary tryptophan level on growth performance of Yangzhou geese

表3 饲喂方式和饲粮色氨酸水平对扬州鹅免疫器官指数的影响Table3 Effects of feeding regimen and dietary tryptophan level on immune organ indices of Yangzhou geese g/kg

表4 饲喂方式和饲粮色氨酸水平对扬州鹅血清免疫球蛋白含量的影响Table4 Effects of feeding regimen and dietary tryptophan level on serum immunoglobulin contents of Yangzhou geese μg/mL

表5 饲喂方式和饲粮色氨酸水平对扬州鹅血清抗氧化指标的影响Table5 Effects of feeding regimen and dietary tryptophan level on serum antioxidant indices of Yangzhou geese

2.4 扬州鹅脾脏组织细胞超微结构的观察结果

由图1可见，低色氨酸水平组扬州鹅脾脏组织的淋巴细胞明显变形，细胞器受到不同程度的损害，核染色质浓缩密集，呈边缘化，线粒体肿胀模糊，嵴出现透亮区、空泡化，粗面内质网脱颗粒明显、排列紊乱，呈现出细胞凋亡的典型变化(图1-A和图1-D)。而中、高色氨酸水平组扬州鹅脾脏组织淋巴细胞结构完整，胞浆中粗面内质网、线粒体及核膜等细胞器未发现有任何明显的异常变化(图1-B、图1-C、图1-E和图1-F)。

图1 10周龄鹅脾脏超细胞微结构图Fig.1 Ultrastructure of cell in spleen of 10-week-old Yangzhou geese

3 讨论

3.1 饲喂方式和饲粮色氨酸水平对扬州鹅生长性能的影响

色氨酸是维持动物生长的必需氨基酸，对动物的采食量有着重要的影响。相对于低色氨酸水平的饲粮，动物会选择性的采食高色氨酸水平的饲粮。Harms等[8]在蛋鸡上研究发现，随着色氨酸水平从0.12%增加到0.20%，商品代蛋鸡的采食量也 呈 显 著 增 加 的 趋 势。Rosa等[9]、Corzo等[10-11]、席鹏彬等[3]、Fatufe 等[12]研究也发现，色氨酸缺乏会导致肉仔鸡采食量受到抑制，在饲粮中补充色氨酸以后，采食量呈不同程度的增加。本研究发现，当采食低色氨酸水平饲粮时，扬州鹅ADFI显著降低，适当添加色氨酸可以改善这一状况，使得ADFI增加，但色氨酸水平过高时，ADFI反而呈下降的趋势，这与以往的研究结果基本一致[3，9-12]。这表明，饲粮中适当的色氨酸水平可以促进动物采食量的提高，色氨酸水平过高或过低都会对采食量产生一定程度的抑制作用。

大量研究表明，饲粮中适当添加色氨酸能产生促进动物生长的明显效果[9-16]。然而这种促生长的作用是由于色氨酸本身的作用还是由于采食量的增加而导致，到目前为止有关的研究还未见报道。本研究表明，与限制饲喂组相比，自由采食组显著提高了扬州鹅的AGD，高、低色氨酸水平组的AGD差异不显著，而中色氨酸水平组扬州鹅的AGD显著高于低色氨酸水平组，饲粮色氨酸水平对 F/G 无显著影响。而 Seve 等[17]、Page 等[18]的研究则表明，在猪饲粮中补充晶体色氨酸，过量添加对其生长性能不会产生有益的影响。结合本研究可以发现，动物采食适当水平的色氨酸可以提高生长性能，这可能主要是由于氨基酸的平衡所致。当动物采食色氨酸水平过高或过低的饲粮，破坏了体内的氨基酸平衡，从而导致氮的利用率降低，进而对鹅的生长性能产生负面影响，而适当的色氨酸水平则能够维持氨基酸的平衡，调节机体的蛋白质代谢，使得机体蛋白质沉积增加，从而改善动物的生长性能。

3.2 饲喂方式和饲粮色氨酸水平对扬州鹅免疫器官指数的影响

免疫器官是动物机体执行免疫功能的组织结构，是淋巴细胞和其他免疫细胞发生、分化、增殖以及产生免疫应答的场所。一般情况下认为，免疫器官指数的提高意味着动物机体免疫系统成熟较快。Kenney等[1]研究发现，色氨酸主要通过促进鼠脾脏细胞增殖、分化及成熟，增加脾脏重量，从而增强动物免疫功能。邱时秀[5]在鼠上研究发现，当在一定色氨酸水平范围内，补充色氨酸可促进脾脏发育，提高脾脏指数。张括等[19]研究发现，当色氨酸水平达到0.252%～0.255%时能显著提高鸭胸腺指数、脾脏指数和法氏囊指数。本试验结果表明，饲粮高色氨酸水平可以显著提高扬州鹅脾脏指数，而对于胸腺指数和法氏囊指数无显著影响，与以往的报道相同。这说明，在低色氨酸水平饲粮中，额外补充色氨酸有利于鹅脾脏器官的生长发育，进而增强动物的免疫功能。

3.3 饲喂方式和饲粮色氨酸水平对扬州鹅血清免疫球蛋白含量的影响

免疫球蛋白是一组具有抗体活性的蛋白质，由浆细胞产生，主要分布在生物体血液和其他体液中。色氨酸作为免疫相关蛋白的限制性氨基酸，在动物体液免疫调节中发挥着重要的作用。Koyanagi等[20]在小鼠上研究表明，与0.20%色氨酸水平组相比，0.08%和0.10%色氨酸水平组的血清γ-球蛋白含量显著降低。当抗体分泌以IgG为主以后，饲粮中色氨酸水平可以增加小鼠血清IgG含量。Kenney等[1]报道，色氨酸缺乏血清IgM的含量降低，推测原因可能是由于色氨酸在稳定多核糖体方面起着重要的作用，有利于球蛋白的合成。邱时秀[5]在鼠上研究发现，随着饲粮中色氨酸水平的增加，血清IgG和IgM含量均呈不同程度地提高。Terron等[21]报道，与对照组相比，色氨酸可以显著降低成年斑鸠夜间血清IgA含量，显著提高成年斑鸠夜间血清IgG含量和白天、夜间血清IgM 含量。Emadi等[22]研究发现，饲喂适量色氨酸水平的饲粮可以显著提高不同时期感染传染性法氏囊病鸡血清IgG含量。本研究发现，与低色氨酸水平组相比，高色氨酸水平组血清IgG和IgM含量显著上升，中色氨酸水平组则呈现不同程度的增加。这表明色氨酸水平能够通过调控IgG和IgM的分泌来影响动物的体液免疫，从而增强动物的抵抗力。

3.4 饲喂方式和饲粮氨酸水平对扬州鹅血清抗氧化指标的影响

动物机体在代谢过程中会产生大量超氧阴离子自由基，这些自由基属于强氧化剂，会对机体组织细胞产生损伤。SOD在机体的氧化与抗氧化平衡过程中起着至关重要的作用，它能够清除超氧阴离子自由基，从而保护组织细胞免受损伤。GSH-Px是动物体内广泛存在的一种重要的分解过氧化物的酶，能特异地催化还原型谷胱甘肽对氢过氧化物的还原反应。MDA含量常常可以反映动物机体内脂质氧化的程度，从而间接地反映出细胞损伤的程度。T-AOC是代表体内抗氧化能力总体水平的一项指标。Terron等[21]在斑鸠上研究表明，色氨酸可以显著增强血清SOD活性，降低血清MDA含量。王波等[23]肉鸡上研究发现，高色氨酸水平可以显著降低肝脏组织中MDA含量。马玉娥等[24]研究表明，与对照组(色氨酸水平为0.16%)相比，0.18%色氨酸水平组的血清过氧化物歧化酶活性显著高于其他各组，适当添加色氨酸(色氨酸水平分别为0.18%、0.20%和0.22%)有提高肉种鸡血清T-AOC和SOD活性，降低血清MDA的趋势。而Cubero等[25]则研究表明，色氨酸对斑鸠组织嗜异细胞MDA含量无显著影响。本试验发现，与低色氨酸水平组相比，中、高色氨酸水平组血清SOD活性和T-AOC显著升高，MDA含量有降低的趋势，这可能是因为动物采食中、高色氨酸水平的饲粮，使得色氨酸的降解量增加，从而使得动物机体的T-AOC提高，进而保护自身组织细胞免受损伤。

3.5 饲喂方式和饲粮色氨酸水平对扬州鹅脾脏组织超微结构的影响

细胞凋亡是细胞的一种基本生物学现象，在细胞的生长和分化、系统发育、免疫系统形成、机体内环境的稳定和疾病的发生等方面起着重要的作用，然而细胞凋亡过多或过少都有可能引起动物机体的发病。Emadi等[22]在传染性法氏囊病的肉鸡上研究发现，色氨酸缺乏可致淋巴小结萎缩，巨噬细胞和浆细胞浸润，淋巴细胞异常，添加色氨酸后可以改善这一状况，使得这种损害得到一定程度的缓解。本试验结果表明，与中、高色氨酸水平组相比，低色氨酸水平组鹅脾脏组织淋巴细胞核染色质浓缩并呈边缘化;线粒体嵴溶解、模糊，甚至消失;内质网脱颗粒明显、排列紊乱，呈现细胞凋亡的特征，表明色氨酸缺乏可引起鹅脾脏组织淋巴细胞生长受到抑制，进而诱导细胞凋亡。

4 结论

①基础饲粮中添加适量的色氨酸能够提高5～10周龄扬州鹅生长性能。色氨酸水平过低或过高都会对扬州鹅生长性能产生不利影响。

②基础饲粮中添加适量的色氨酸可显著增加扬州鹅脾脏指数，有利于脾脏的生长发育，增强动物机体的体液免疫和抗氧化能力。

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