大鼠血清的4种处理方法对2－DE效果的影响

张 彬，谭 岩

（1．吉林大学第一临床学院，吉林 长春130021；2．内蒙古民族大学附属医院，通辽028007；3．吉林省人民医院 医学诊治实验中心，吉林 长春130021）

血液中蕴藏着与疾病发生机制、早期诊断及预后评估密切相关的巨大信息，已成为临床上最为常见且最为重要的诊断标本。从血液中发现生物标记物是蛋白质组学研究的重点之一。双向电泳技术目前仍是蛋白质组学的主要实验技术，而样本的准备是实验成功的关键。血浆／血清中包含多种多样蛋白质，蛋白质的浓度范围至少达12个数量级，其中高丰度蛋白中前22种蛋白在血浆蛋白质中占99%，白蛋白和免疫球蛋白就占血浆总蛋白的60%，低丰度蛋白仅占全部血浆蛋白的1%，而疾病的标志物常常是在疾病过程中由机体分泌到血浆中的低丰度蛋白质。高丰度蛋白的存在对目标蛋白质的分析造成极大困难［1，2］。本实验分析了4种大鼠血清处理方法对双向电泳分离效果的影响，为血清双向电泳标本的处理提供参考。

1 材料与方法

1．1 标本

wistar雌性大鼠，体重180－220g，购于吉林大学白求恩医学部实验动物中心。大鼠眼球取血，静止分离血清，3 000r／min，离心10min，分装后冻存于－80℃冰箱。

1．2 试剂和仪器

1．2．1 尿素（Urea）、硫脲（Thiourea）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、3－［（3－胆酰胺丙基）－乙二胺］－1－丙磺酸（CHAPS）、赖氨酸（Lysine）、二硫苏糖（DTT）、两性电解质（Pharmalyte，pH 3－10）、13cm 固相pH 梯度干胶条（pH 3－10）、甘油（Glycerol）、十二烷基磺酸钠（SDS）、碘乙酰胺（Iodoacetamide，IAA）、丙烯酰胺（Acrylamide）、甲叉双丙烯酰胺（N，N＇－methylenebisacrylamide）、过硫酸铵（APS）、四甲基乙二胺（TEMED）、甘氨酸（Glycine）、琼脂糖、2－D Quant定量试剂盒均购自Amersham Biosciences公司；异丁醇、溴酚蓝（Bromophenol blue）、丙酮、三氯乙酸（TCA）均购自北京化工厂（北京北化精细化学品有限责任公司）。

ProteoExtract Protein Precipitation和 KitProteoExtractTMAlbumin／IgG Removal Kit均 购 于Merck公司。

1．2．2 仪器：Ultrospec 3300Pro分光光度计、Ettan IPGphorⅡ等电聚焦电泳仪、Ettan DALT Six电泳系统、凝胶图像扫描仪（ImageScanner）。

1．3 实验方法

1．3．1 方法1，取5μl大鼠血清用45μl裂解液直接溶解。

1．3．2 方法2，取大鼠血清用 ProteoExtract Protein Precipitation Kit处理后，取适量裂解液溶解。

1．3．3 方法3，改良的 TCA／丙酮沉淀法：在20μl大鼠血清中加入80μl预冷的10%TCA／丙酮溶液，混匀，－20℃放置90min后，12 000g，4℃，离心20 min。移开上清，用1ml预冷的丙酮洗沉淀，置于冰上15min，离心同上。

1．3．4 方法4，按照 ProteoExtractTMAlbumin／IgG Removal Kit说明书操作。取35μl大鼠血清，以结合缓冲液（Binding Buffer）十倍稀释。去除分离柱中的贮存缓冲液，将柱子放入大小适合的收集试管，加入850μl结合缓冲液，让其靠重力流过柱体，将柱子放入另一收集试管中。加入稀释后的样本，让其靠重力流过柱体，以600μl结合缓冲液清洗柱体两次，上述三步的洗脱组份，即为去除白蛋白／IgG后的样本。用 ProteoExtract○RProtein Precipitation Kit（购于Merck公司）沉淀蛋白。

1．3．5 将以上4种方法处理过的蛋白用裂解液溶解后，用Bradford法测蛋白浓度取100μg用13cm IPG干胶条水化12h，等电聚焦条件为250V，1h；500V，1h；1 000V，1h；8 000V，1h；8 000V，4h。聚焦完毕后，将胶条放置于滤纸上，轻轻吸干胶条上的矿物油后分别将胶条在含有1%DTT和2．5%碘乙酰铵的平衡液中平衡15min。将平衡后的胶条移至浓度为10%（方法2）或12．5%的SDS－PAGE胶上进行双向电泳，条件为10mA／胶1h，25mA／胶恒流，直至溴酚蓝达胶底线。卸胶，进行硝酸银染色，染色后用凝胶图像扫描仪（ImageScanner）获取图像后用ImageMasterTM2DPlatinum（GE Healthcare）软件分析。

2 结果

2．1 不同方法处理后的双向电泳图谱比较

未经处理的大鼠血清样品，经双向电泳后，存在大量的纵横条纹，几乎无蛋白点（见图1a），蛋白质点分离效果差。经试剂盒去除杂质并沉淀，但未去除高丰度蛋白的血清样品，电泳图谱得到的蛋白位点仍很少，同时纵横条纹多（（见图1b））；用TCA－丙酮法处理的样本电泳图谱虽有较多粗的纵横条纹，但所得的蛋白点数明显增多，有较多呈圆点状，散在分离的蛋白点出现（图1c）；采用ProteoExtractTMAlbumin／IgG Removal Kit血清样本电泳图谱所得的蛋白点较多，纵衡条纹明显见少，大多数蛋白位点呈圆点状，散在分离，边界分辨清楚。见图1。

2．2 不同处理方法后样品的2－DE图谱比较

分别将未经处理的大鼠血清，经试剂盒沉淀（购于Merck公司）的大鼠血清，在一定量的血清中加入4倍体积的10%TCA／丙酮的方法处理和用ProteoExtractTMAlbumin／IgG Removal Kit处 理的大鼠血清的2－DE图谱进行3次重复性检测，平均蛋白质点数分别为610±54，610±46，683±42和865±39，平均匹配点数分别为532±39，543±51，623±42和746±52，匹配率分别为83．4%，86．2%，82．3%和85．5%，且3块胶在蛋白质点位置上有较好的重复性，不同凝胶间蛋白质点在IEF方向的偏差分别为（0．87±0．31）mm，（0．79±0．23）mm，（0．82±0．33）mm 和（0．85±0．30）mm，在SDS－PAGE方向上的偏差分别为（0．84±0．42）mm，（0．81±0．39）mm，（0．99±0．16）mm 和（0．97±0．12）mm。由此可见采用在一定量的血清中加入4倍体积的10%TCA／丙酮的方法处理和用ProteoExtractTMAlbumin／IgG Removal Kit处 理的大鼠血清的这两种去除白蛋白的方法处理大鼠血清后均能得到分辨率较高且重复性好的蛋白质双向凝胶电泳图谱，且采用ProteoExtractTMAlbumin／IgG Removal Kit优于在一定体积的血清中加入4倍体积的10%TCA／丙酮的方法。4种方法处理后大鼠血清双向电泳图谱结果比较见图1。

图1 4种不同方法处理大鼠血清得到的2－DE图谱

3 讨论

Hyoung－Joo Lee等［3］认为对血浆或血清进行预处理可以降低样品的复杂性，为低丰度蛋白的检测创造条件还可以将检测蛋白质的动力学范围延伸以利于后续的质谱分析。现在低丰度蛋白的富集方法主要有［4］①亲和技术包括染料亲和法抗体亲和法，②有机溶剂抽提法③血浆蛋白的预分离技术包括二维液相色谱法、Zoom IEF组分分离法、介体电泳技术（Gradiflow法）及自由流电泳等。蛋白质是两性电解质，在不同的PH中各解离基团解离程度不同，当溶液的PH值与蛋白质的等电点相同时，蛋白质分子呈现电中性，分子间无排斥力，易于积聚和沉淀。溶液的极性可以影响蛋白质的溶解度，有机溶剂的加入降低了溶液的介电常数而增加蛋白质分子间的作用力，导致其溶解度降低，同时破坏蛋白质表面的水化膜，减少了蛋白质与水间的作用力使蛋白质沉淀。Oleg Chertov等［5］对有机溶剂沉淀血清中蛋白质进行了质谱鉴定，鉴别生物标志物。AJ．Alpert等［6］报道使用ACN沉淀血浆中高分子量的高丰度蛋白以相对富集低丰度蛋白。Chen等［7］发明了一种改良的TCA／丙酮沉淀法，将一定体积的血清中加入4倍体积的10%TCA／丙酮溶液，可有效地去除血清中的白蛋白，并且去除白蛋白的特异性很高。市场上应用亲和技术去除血浆／血清中的高丰度蛋白试剂盒很多，常用的有基于抗体的亲和法和基于染料的亲和法。抗体亲和法利用抗原抗体反应的原理，用针对血浆／血清中多种高丰度蛋白的单克隆或多克隆抗体来特异性去除血浆中的高丰度蛋白；染料亲和法通过高丰度蛋白与染料环结构之间复杂的静电、疏水键及氢键相互作用去除血浆中的高丰度蛋白，其特异性相对较低。

大鼠血清样本经以上4种方法处理后，双向电泳图像分析结果显示，未经处理的大鼠血清中不但包含高丰度蛋白而且含有高浓度的盐类，脂类和核酸等，严重干扰了蛋白点的分离，图像中含有大量横纹及纵纹，蛋白质点分离效果差。经过试剂盒沉淀但未去除白蛋白的大鼠血清样本由于白蛋白含量高，干扰了低丰度蛋白的检测，用银染的方法进行染色时，当低丰度蛋白显色时由于染色时间已过长胶片上出现大量横纹。用改良的TCA／丙酮沉淀法处理的大鼠血清样本，虽然白蛋白去除并不完全但蛋白质点分离较好。采用ProteoExtractTMAlbumin／IgG Removal Kit处理大鼠血清样本后，双向电泳图谱中可见对白蛋白的去除效果较好，但对IgG的去除效果不理想，但相对其他3种方法，蛋白质点更加清晰，分离较好。综上所述，用改良的TCA／丙酮沉淀法和采用ProteoExtractTMAlbumin／IgG Removal Kit处理的大鼠血清样本，进行双向电泳均可以得到蛋白质点分散较好的电泳图谱，且后者更优于前者，但改良的TCA／丙酮沉淀法取材容易、实验成本低、可重复性好，两种方法各有优势。

［1］Anderson N L，Anderson N G．The human plasma proteome：history，character，and diagonostic prospects［J］．Mol Cell Proteomics，2002，1（11）：845．

［2］M．Fountoulakis，J．－F．Juranville，L．Jiang．Depletion of the highabundance plasma proteins［J］．Amino Acids，2004，27：249．

［3］Hyoung－Joo Lee，Eun－Young Lee，Min－Seok Kwon，et al．Biomarker discovery from the plasma proteome using multidimensional fractionation proteomics［J］．Current Opinion in Chemical Biology，2006，10：42．

［4］邱宗荫，尹一兵．临床蛋白质组学［M］．北京：科学出版社，2008．162－175．

［5］Oleg Chertov，Arya Biragyn，Larry W．Kwak．Organic solvent extraction of proteins and peptides from serum as an effective sample preparation for detection andidentification of biomarkers by mass spectrometry［J］．Proteomics，2004，4，1195．

［6］AJ．Alpert，A．K．Shukla．Precipitation of large，high－abundance Proteins from serum with Organic solvents，ABRF 2003，Poster#Plll－W．

［7］Chen Y，Lin S，Yeh YY，et al．A modified protein precipitation procedure for efficient removal of albumin from serum［J］．Electrophoresis，2005，26：2117．