厄贝沙坦联合瑞舒伐他汀影响冠心病大鼠心肌及主动脉干s分泌型磷脂酶表达的实验研究

郭丽蓉 孙常青

厦门大学附属第一医院干部科，福建厦门 361003

冠状动脉粥样硬化性心脏病（CHD）又称缺血性心脏病，是因冠状动脉供血不足，心肌急剧的、暂时的缺血与缺氧所引起的综合征，常引发心绞痛、心肌梗死以致心力衰竭等的临床病症，严重威胁着人们的生命健康。冠心病的病理、生理过程，包括动脉粥样硬化、斑块破裂及局部血栓形成、冠状动脉痉挛等。分泌型磷脂酶A2（typeⅡsecretory phospholipase A2，sPLA2）属于钙依赖的磷脂酶家族，有研究提示，sPLA2影响了动脉粥样硬化过程，并在粥样斑块中有高度表达[1]。sPLA2-Ⅴ是sPLA2异构体之一，其在动脉粥样硬化形成中的作用鲜有报道，本研究通过观察厄贝沙坦联合瑞舒伐他汀干预影响冠心病大鼠模型心肌及主动脉干sPLA2-Ⅴ的表达，以分析其在冠心病发病过程中所起的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康雄性Wistar大鼠50只，体质量180～220 g，由武汉大学动物实验中心提供。

1.2 药物及主要试剂

厄贝沙坦（杭州赛诺菲安万特民生制药有限公司，批准文号：J20030113）；瑞舒伐他汀（阿斯利康制药有限公司，批准文号：H20060406）；垂体后叶素注射液（上海第一生化药业有限公司）；胆固醇（天津市博迪化工有限公司生产）；胆酸钠（郑州程达化工产品有限公司）；丙硫氧嘧啶（德国赫尔布兰德大药厂）；sPLA2-Ⅴ抗血清、sPLA2-Ⅴ单克隆抗体及检测试剂盒（Boehringer Mannheim公司）；DAB（武汉子心生物科技有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组 50只Wistar大鼠自由饮水进食，饲养于18～22℃的清洁级动物实验室内，正常喂养1周后，随机分为正常组、模型组、厄贝沙坦组、瑞舒伐他汀组及厄贝沙坦联合瑞舒伐他汀组（简称联合用药组），每组各10只。

1.3.2 动物造模 正常组以普通饲料喂养，其余各组大鼠每日以高脂饲料喂养（含2%胆固醇、10%猪油、0.2%丙基硫氧嘧啶、0.5%胆酸钠、87.3%基础饲料，于末次灌胃前72 h开始，每次灌胃30 min后，腹腔注射垂体后叶素30 U/kg，隔日1次，连续注射3次，建立冠心病心肌缺血模型[2-3]。正常组予以等容量的生理盐水注射。

1.3.3 给药方法 大鼠造模成功后，各组大鼠以相应的药物给药，厄贝沙坦组大鼠以厄贝沙坦 50 mg/（kg·d）灌胃；瑞舒伐他汀组大鼠以瑞舒伐他汀10 mg/（kg·d）灌胃；联合用药组予厄贝沙坦 50 mg/（kg·d）+瑞舒伐他汀 10 mg/（kg·d）灌胃；正常组和模型组予以每日2 mL生理盐水灌胃，均持续12周。

1.4 检测指标

1.4.1 采集标本 给药12周后，各组大鼠禁食12 h，麻醉后迅速开胸剖取心脏和主动脉，于心尖部取适量的左心室心肌组织，将心肌组织和主动脉用预冷0.9%氯化钠注射液冲洗，滤纸吸湿后，放入4%多聚甲醛液中固定。

1.4.2 免疫组化检测sPLA2-Ⅴ的表达 取上述心肌组织和主动脉标本，立即送冰冻切片，厚度10 μm，分别加入1∶100的sPLA2-Ⅴ抗血清及8.8 mg/L的sPLA2-Ⅴ单抗，室温孵育2 h，PBS冲洗DAB显色。sPLA2-Ⅴ阳性细胞呈棕紫蓝色，位于细胞浆内，高倍镜下随机选取5个视野，每个视野观察细胞数不少于200个，按阳性细胞所占百分比及着色深浅进行结果判定[4]，①按照阳性细胞比例评分，1 分：＜10%，2 分：10%～50%，3分：＞50%；②按染色强弱评分，0分：阴性；1分：淡黄色染色；2分：中度黄色染色；3分：棕黄色染色。总分=阳性细胞得分×染色强弱得分，总分＜3分为阴性，总分≥3分为阳性。以PBS代替一抗作为空白对照，采用试剂公司提供的阳性组织切片作阳性对照，正常心肌组织和主动脉标本作为阴性对照。

1.4.3 Western blot检测sPLA2-Ⅴ表达水平 取上述心肌组织和主动脉标本，加入1 mL组织裂解液，于冰浴中匀浆20次，随后转入EP管中，4℃离心1 h，取上清，以微量Lowrry法测定sPLA2-Ⅴ蛋白含量。

1.5 统计学方法

所有数据采用SPSS 13.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验，计数资料采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 sPLA2-Ⅴ在各组心肌组织及主动脉中的表达比较

见表1。

表1 sPLA2-Ⅴ在各组心肌组织及主动脉中的表达比较（n=10）

2.2 sPLA2-Ⅴ在各组心肌组织及主动脉中的表达水平比较

见表2。

表2 sPLA2-Ⅴ在各组心肌组织及主动脉中的表达水平比较（±s，U/mL，n=10）

表2 sPLA2-Ⅴ在各组心肌组织及主动脉中的表达水平比较（±s，U/mL，n=10）

注：与正常组比较，★P ＜ 0.05，※P ＜ 0.01；与模型组比较，△P ＜ 0.05，▲P＜0.01；与厄贝沙坦组及瑞舒伐他汀组比较，●P＜0.05

组别 sPLA2-Ⅴ表达水平心肌组织 主动脉正常组模型组厄贝沙坦组瑞舒伐他汀组联合用药组1.51±1.23 6.43±1.55※4.25±0.87★△4.67±0.59★△2.04±1.11▲●2.06±1.17 7.81±1.96※4.13±1.02★△4.75±1.27★△2.88±1.64▲●

3 讨论

SPLA2主要由血管壁平滑肌细胞与巨噬细胞等产生，在正常的动脉中，sPLA2主要分布于中膜的平滑肌细胞。在动脉粥样硬化斑块中，sPLA2主要与胶原纤维一起位于巨噬细胞集聚区、粥样硬化的脂质核心区以及病变血管内膜的细胞外基质内。sPLA2-Ⅴ是近几年发现的新的sPLA2的分型，其主要分布在人和鼠类的心脏及来源于巨噬细胞中。国外研究中发现sPLA2-Ⅴ可在动脉粥样斑块中检测出来。

血管紧张素转换酶抑制剂（angiotensin-converting enzyme inhibitors，ACEI）是一类抗高血压和抗充血性心力衰竭药，能扩张冠状动脉，减轻心脏前后负荷，降低心肌耗氧，对抗心脏RAS的缩血管和水钠潴留作用，中断心力衰竭时的心脏恶性循环[4]。厄贝沙坦是ACEI类药物，研究发现厄贝沙坦可降低sPLA2的表达及相应产生的脂质过氧化反应，从而起到抗动脉粥样硬化的作用[5]。由此推测厄贝沙坦也可能抑制sPLA2-Ⅴ的表达起到抗动脉硬化的作用。另外，有学者指出，在冠心病心绞痛扩张冠状血管治疗的同时，调解血脂，对改善血液流变性至关重要[6]。阿托伐他汀对sPLA2Ⅱα在动脉粥样硬化大鼠表达的影响也有报道。但是有关于sPLA2-Ⅴ与瑞舒伐他汀药物相关性的研究尚未报道。

本课题以厄贝沙坦、瑞舒伐他汀、厄贝沙坦联合瑞舒伐他汀干预冠心病大鼠模型后，免疫组化结果显示，正常大鼠心肌及主动脉组织中sPLA2-Ⅴ呈阴性表达，而冠心病模型大鼠sPLA2-Ⅴ均呈强阳性表达，而经过厄贝沙坦、瑞舒伐他汀干预后，sPLA2-Ⅴ表达减弱，但联合用药组表达最弱，接近正常组，说明厄贝沙坦及瑞舒伐他汀均可以抑制sPLA2-Ⅴ表达，但以联合用药效果最显著。另外，Western blot蛋白定量结果也显示，sPLA2-Ⅴ在模型组中高表达，显著高于其余各组，但经过药物干预后，厄贝沙坦、瑞舒伐他汀及联合用药组sPLA2-Ⅴ表达水平显著下降，以联合用药组下降最显著，说明厄贝沙坦联合瑞舒伐他汀用药下调sPLA2-Ⅴ表达效果显著优于单一用药。

综上所述，贝沙坦联合瑞舒伐他汀可能通过抑制心肌及主动脉干sPLA2-Ⅴ的表达起到抗动脉粥样硬化治疗冠心病作用，可作为心血管疾病高危人群的一级预防用药。

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[2]张明雪，常艳鹏，曹洪欣.温阳活血中药复方调控冠心病（心）阳虚血瘀证大鼠血小板内受体、信号转导的作用机制研究[J].中华中医药杂志，2008，23（6）：494-497.

[3]李昌，胡巍巍，高玮，等.益气化痰瘀方对冠心病大鼠的保护作用[J].河北中医药学报，2010，25（1）：3-5.

[4]朱明燕，柳景景，石雷.血管紧张素转换酶抑制剂研究进展与临床应用[J].中国医药导报，2011，8（1）：9-10.

[5]Burstein B，Nattel S.Atrial fibrosis：mechanisms and clinical relevance in atrial fibrillation[J].J Am Coll Cardiol，2008，51：802-809.

[6]曹辉，卢长虹，聂广邻.血栓通治疗冠心病心绞痛的临床观察[J].中国医药导报，2011，8（21）：14-16.