中药复方调控肝干细胞分化及机制的实验研究

陈利锋 赵映前 刘建忠 胡爱萍

1.湖北中医药大学，湖北武汉 430065；2.湖北省中医院，湖北武汉 430070

肝干细胞是体内存在的一种具有自我增殖能力和多向分化潜能的干细胞，可以分化为肝细胞和胆管上皮细胞等多种细胞。肝干细胞可参与肝脏的修复与重建，也是肝细胞移植、生物人工肝的重要细胞来源。近年来，人们发现肝干细胞移植对急慢性肝脏疾病有明确的治疗作用，使得肝干细胞的研究成为热点[1-2]。研究中选用西洋参、牛黄配伍，具有“益气养阴、清热解毒”之功，现代药理研究证明牛黄、西洋参在改善肝功能、降低转氨酶、抑制肿瘤细胞增殖等方面具有很好疗效，但对肝干细胞的作用尚不十分清楚[3]。本实验研究不同浓度牛黄参含药血清对大鼠肝干细胞系WB-F344的增殖、诱导分化作用，观察在诱导分化过程中细胞因子受体表达的变化，探讨牛黄、西洋参复方对肝干细胞增殖、分化的影响，进一步揭示益气解毒法对WB-F344细胞的作用机制。

1 材料与试药

1.1 动物

48只 SPF级雄性 Wistar大鼠，体重 180～200 g，由湖北省实验动物研究中心提供，许可证号SCXK（鄂）2008-0005。鼠肝干细胞系WB-F344购自上海复祥生物科技有限公司。

1.2 试药

体外培育牛黄、西洋参、牛黄参胶囊均由武汉健民大鹏药业有限公司提供。DMEM高糖液体培养基（HYCLONE），10%灭活的特优级胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），无菌磷酸盐（PBS）缓冲液（武汉博士德），青霉素、链霉素双抗（西化仪北京科技有限公司）。胰蛋白酶、MTT、DMSO（美国GIBCO公司分装）。地塞米松磷酸钠注射液（湖北天药药业股份有限公司），胰岛素（安徽宏业药业有限公司），Trizol（总RNA抽提剂）、一抗稀释液及二抗稀释液（碧云天生物技术研究所生产），上、下游引物（BIONEER），Fermentas逆转录试剂盒（美国 MBI）。 HGF、EGF（美国派普泰克公司）。 兔抗鼠的 HGFR、EGFR 多克隆抗体、兔抗鼠的 TGFβR1、TGFβR2多克隆抗体（美国BIOWORLD公司），羊抗鼠的EGF多克隆抗体（美国SANTA CRUZ公司），辣根过氧化物酶HRP标记的兔抗羊抗体和山羊抗兔的二抗（美国BIOWORLD公司）。考马斯亮蓝G-250、考马斯亮蓝R-250、Tween-20（武汉华顺生物科技有限公司），预染标准分子量蛋白Marker（FERMENTAS 公司）、丽春红 S（SIGMA 分装），TBS 缓冲液（10×）（BIOSHARP公司），ECL发光试剂盒（美国SANTA CRUZ公司），无水乙醇、甲醇、氯仿、异丙醇、苯酚（国药集团化学试剂有限公司），牛血清白蛋白（武汉市贝尔生物技术有限公司）。GAPDH（上海康成生物工程有限公司）。

2 方法与结果

2.1 含药血清的制备

将大鼠分为空白组、水煎组、成分组，水煎组与成分组互为对照，每组各16只。体外培育牛黄、西洋参配伍组采用传统水煎法灌胃动物制作含药血清（水煎组）；牛黄参胶囊是由西洋参和天然牛黄的替代品体外人工培育牛黄组方而成，取粉稀释使用灌胃动物制作含药血清（成分组）。各组给相应的药物连续灌胃7 d（1次／d），给药浓度为：含牛黄生药浓度3.6 g/L，含西洋参生药浓度21.6 g/L，大鼠按体重100 g灌胃1 mL的量给药，空白组灌胃等量的生理盐水，连续1周，末次给药后2 h进行大鼠颈动脉取血，将采集的血液在室温中静置 4 h，3 000 r/min，离心 15 min，将收集的血清在 56℃水浴30 min进行灭活，而后过滤除菌，分装成小瓶于-20℃保存备用，需要时用培养液配制成不同浓度的含药血清。

2.2 细胞的培养

用50 mL的培养瓶，将WB-F344接种于含10%胎牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺、100 U/mL青霉素及链霉素的高糖DMEM培养基中，细胞浓度为2×104个/mL，置于5%CO2、37℃的培养箱中培养。细胞换液时间为2～3 d，3～5 d传代，0.25%胰蛋白酶消化后1∶2传代。

2.3 MTT法检测细胞的增殖

取对数生长期WB-F344细胞用胰酶消化，调密度为1×105/mL，按每孔100 μL接种96孔细胞培养板。于37℃、5%CO2条件下，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基培养24 h后，分别加入浓度为5%、10%、20%的成分组与水煎组药物血清，空白对照组加入5%、10%、20%的正常大鼠血清，正常对照组加入等量的培养液，以上每个浓度设6个平行孔，作用 24 h，每孔再加入 5 mg/mL MTT 25 μL，4 h 后弃上清液，加入DMSO 125 μL/孔，振荡5 min左右，置于酶标仪上490 nm波长处测定吸光度OD值。

2.4 Western blot检测细胞因子及受体的表达

以1×105/mL密度接种WB-F344细胞，待细胞长至80%时，无血清同步化24 h，加入10%成分组和水煎组的药物血清干预，24 h裂解收集细胞，再加入细胞裂解液冰面上裂解20 min，离心处理后收集上清即得总蛋白样品。采用考马斯亮蓝法测蛋白浓度，去离子水稀释蛋白浓度至2.5 μg/μL，按照每孔上样总蛋白的量50 μg，每条泳道上样20 μL。在进行SDS-PAGE电泳之前，需将配好的蛋白样品置入95℃加热5 min使蛋白变性。制备凝胶电泳，将蛋白转移至硝酸纤维素滤膜上，加入封闭液37℃封闭1 h。封闭完毕后，用TBST洗涤液洗涤膜条3次，每次10 min。1∶1 000稀释一抗，低温孵育过夜。一抗孵育完毕后，用TBST洗涤液洗涤膜条3次，每次10 min。1∶500稀释二抗，37℃孵育2 h，应用增强的化学发光法显影，曝光洗片，Band scan分析胶片灰度值。

2.5 RT-PCR检测ALB mRNA的表达

取密度为5×103/孔WB-F344细胞接种于细胞培养板，8 h后换分化培养体系（高糖DMEM、10%胎牛血清、HGF 50 ng/mL、EGF 20 ng/mL、胰岛素 1 μg/mL、地塞米松 1 μmol/L），加入10%成分组和水煎组的含药血清，并设正常对照孔和空白血清对照孔。1～5 d用 HGF 50 ng/mL，后改为 10 ng/mL维持，3 d换液 1 次，连续培养，于 0、7、10、14、21 d 分别收集分化培养细胞，裂解液提取总RNA，测定RNA浓度，用RT试剂盒将RNA反转录为cDNA，然后以cDNA的第1链为模板进行PCR扩增，引物由BIONEER公司合成。PCR反应条件为94℃预变性4 min，然后按 94℃变性30 s→55℃退火 30 s→72℃延伸30 s，循环35次后，72℃延伸10 min。应用千屏多媒体凝胶成像系统对DNA电泳条带进行分析，测定各条带的面积和灰度值，得出积分灰度值，计算各个样品与β-actin的比值作为ALB mRNA表达的相对定量，重复4次。

2.6 统计学方法

采用SPSS 13.0软件进行分析，计量资料数据以均数±标准差（±s）表示，多组均数间比较行完全随机设计的方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2.7 结果

2.7.1 MTT检测牛黄参含药血清对WB-F344细胞增殖的影响 结果表明，10%、20%浓度的牛黄参含药血清成分组和水煎组均能刺激WB-F344细胞的增殖，与空白、正常对照组比较OD值显著升高（P<0.01），且10%为细胞增殖的最佳浓度梯度；各组含药血清对WB-F344细胞作用24 h后，未表现出对细胞的毒性作用，镜下观察各组细胞生长良好。见表1。

2.7.2 Western blot检测牛黄参含药血清对WB-F344细胞因子及受体表达的影响 结果表明，牛黄参含药血清成分组和水煎组均可以刺激WB-F344细胞因子，HGFR、EGF、EGFR、TGF-β1R、TGF-β2R 的表达量升高，与正常组、空白组比较，差异均有统计学意义（均P<0.01）。见表2。

2.7.3 RT-PCR检测牛黄参含药血清对WB-F344细胞ALB mRNA表达的影响 表3结果表明，牛黄参含药血清成分组和水煎组干预的WB-F344肝干细胞表面标志物ALB mRNA的表达在分化过程中随着时间的延长逐渐增多；增涨幅度与正常组、空白组比较，差异均有统计学意义（均P<0.01），且成分组优于水煎组。见表3。

表1 不同浓度牛黄参含药血清对WB-F344增殖的影响（±s，n=6）

表1 不同浓度牛黄参含药血清对WB-F344增殖的影响（±s，n=6）

注：与正常组比较，P<0.01；与空白组比较，P<0.01；与 5%比较，●P<0.01

组别OD值正常组空白组5%10%20%成分组5%10%20%水煎组5%10%20%1.068 000±0.155 004 1.113 567±0.138 459 1.170 167±0.174 112 1.120 533±0.118 125 1.083 517±0.072 461 1.432 433±0.093 332★▲●1.409 067±0.184 952★▲●1.078 950±0.073 443 1.391 367±0.065 870★▲●1.321 733±0.051 570★▲●★▲

3 讨论

一直以来，许多学者致力于寻找能够刺激肝细胞再生的基本因子，迄今关注较多的是肝细胞生长因子（HGF）、干细胞生长因子（SCF）、表皮生长因子（EGF）、酸性成纤维细胞因子（FGF）、转化因子 β1（TGF-β1）、转化因子 β2（TGF-β2）、角质细胞因子、干扰素、白细胞介素-1、白细胞介素-6和胰岛素等等。已证实在肝脏受损后的肝细胞修复过程中，这些细胞因子通过促进肝干细胞的增殖、分化以及拮抗其凋亡起着重要的调控作用[4]。

HGF是最早被认识在肝再生过程中起重要作用的细胞因子之一，通过与受体HGFR相互作用而对多种细胞产生促有丝分裂作用及促形态形成作用，在肝脏的发育成熟和再生过程中发挥重要作用，是干细胞向正常肝细胞分化有效的刺激因子之一。不过，其在细胞膜上受体数目相对固定，当HGF达到受体饱和的浓度后，单纯HGF刺激将呈现出一定的饱和效应。在发育的肝脏中，HGF诱导ALB阴性的干细胞分化为ALB阳性的干细胞，然后再在其他因素的作用下分化为成熟的肝细胞[5]。EGF是作用于肝干细胞增殖与分化的另一重要的细胞因子，通过与靶细胞膜上的受体EGFR结合刺激肝干细胞的增殖。EGF/EGFR在肝再生早期阶段有促进有丝分裂的作用，并且鼠类比人类显得尤为重要，是鼠类肝再生的必要条件。 TGFβ 家族（包括 TGF-β1，TGF-β2及 TGF-β3）可以抑制小鼠卵圆细胞系的有丝分裂，调节肝干细胞的增殖、分化，使其向成熟肝细胞和胆管细胞分化，而不向肝细胞癌或胆管细胞癌方向发展，其中TGF-β1在体细胞中所占比例最高、活性最强、分布最广[6-9]。

肝脏是合成ALB的唯一场所，几乎所有的肝细胞体外诱导分化试验都以ALB作为首选的检测指标。因为ALB是检测肝细胞代谢活性的一个标志物，也是反应肝干细胞和成熟肝细胞活性和功能良好的指标之一[10-11]。本实验结果显示，经中药复方牛黄参含药血清干预后，WB-F344细胞增殖明显，10%为药物血清增殖的最佳浓度梯度；HGFR、EGF、EGFR、TGF-β1R、TGF-β2R 表达量升高；ALB 表达显著增多；而未经药物诱导的WB-F344对照组变化不显著。提示牛黄、西洋参复方制剂能诱导肝干细胞系WB-F344向成熟肝细胞方向分化发育，且成分组牛黄参胶囊优于水煎剂，这为应用合适的中药复方剂型治疗重型肝炎、肝衰竭开辟了一条新途径，也为中西医结合治疗肝病提供了一条新思路。这些只是研究的初步结果，在中药复方牛黄参诱导WB-F344细胞分化过程中是否还存在其他因素参与调节以及调节过程中具体的信号通路如何，均有待于进一步研究。

表2 牛黄参含药血清对WB-F344细胞因子及受体表达的影响（±s，n=4）

表2 牛黄参含药血清对WB-F344细胞因子及受体表达的影响（±s，n=4）

注：与正常组比较，★P<0.01；与空白组比较，▲P<0.01

指标组别正常组 空白组 成分组 水煎组HGFR TGF-β1R TGF-β2R EGFR EGF 1.039 75±0.002 44 1.417 99±0.001 81 0.975 69±0.001 97 1.227 48±0.000 82 1.361 38±0.000 61 1.046 88±0.003 12 1.368 05±0.002 39 0.990 62±0.002 01 1.249 33±0.000 58 1.348 89±0.002 05 1.323 66±0.003 55★▲1.733 37±0.001 11★▲1.241 94±0.000 55★▲1.548 33±0.002 85★▲1.770 18±0.020 83★▲1.360 02±0.001 36★▲1.748 47±0.006 98★▲1.197 18±0.000 32★▲1.530 61±0.001 47★▲1.633 80±0.020 15★▲

表3 牛黄参含药血清对WB-F344细胞ALB mRNA表达的影响±s，n=4）

表3 牛黄参含药血清对WB-F344细胞ALB mRNA表达的影响±s，n=4）

注：与正常组比较，★P<0.01；与空白组比较，▲P<0.01

时间（d） 正常组 空白组水煎组071 0 14 21 0.979 28±0.005 77 1.001 35±0.001 96 1.015 06±0.000 39 1.032 19±0.002 07 1.055 37±0.004 52 0.979 35±0.006 92 1.002 70±0.004 50 1.014 89±0.000 34 1.031 20±0.000 22 1.054 97±0.002 27 0.977 80 1.025 08±0.017 84 1.051 86±0.002 72 1.132 82±0.002 29★1.179 03±0.003 01★0.976 16±0.005 97 1.004 71±0.003 30 1.035 07±0.005 11 1.118 96±0.001 48★1.142 45±0.002 61★

[1]Chamuleau RA，Deurholt T，Hoekstra R.Which are the right cells to be used in a bioartificial liver? [J].Metab Brain Dis，2005，20（4）：327-350.

[2]Zdziarski P.Cellular transplantation-orthotopic liver transplantation al-ternative[J].Pol Merkur Lekarski，2007，23（136）：297-301.

[3]李玲青，赵映前.牛黄参含药血清对人肝癌细胞HepG2的作用机理研究[D].武汉：湖北中医药大学：2010.

[4]姚鹏，詹秩群，许望翔，等.细胞生长因子体外对大鼠肝干细胞的影响[J].中华肝脏病杂志，2003，11（1）：33-36.

[5]Suzuki A，Iwama A，Miyashita H，et al.Role for growth factors and extracelluar matrix in controlling differentiation of prospectively isolated hepatic stem cells[J].Development，2003，130：2513-2524.

[6]林泽伟，陈斌，倪勇，等.大鼠骨髓间充质干细胞分化为肝样细胞的实验研究[J].中国热带医学，2006，6（4）：574-576.

[7]高植泉，陶开山，李韧，等.体外不同诱导条件下对大鼠胚胎肝干细胞分化影响的实验研究[J].胃肠病学和肝病学杂志，2010，19（6）：513-515.

[8]Lee BS，Park M，Cha HY，et al.Hepatocyte growth factor induces delayed STAT3 phosphorylation through interleukin-6 expression[J].Cell Signal，2009，21（3）：419-427.

[9]邝郁郁.不同浓度肝细胞生长因子和成纤维细胞生长因子对大鼠肝干细胞的增殖调控[J].国际病理科学与临床杂志，2010，30（2）：106-109.

[10]杨志云，姚树坤，殷飞，等.苦参碱含药血清对大鼠肝干细胞的影响[J].中华实验和临床感染病杂志，2008，2（2）：33-36.

[11]曲鑫建，李惠侠，孙世铎，等.模拟微重力条件下对WB-F344肝干细胞表征分子表达的影响[J].中国生物工程杂志，2007，27（10）：17-21.