乙型肝炎病毒X蛋白、雄激素受体及p53蛋白在肝细胞癌中的表达及意义

陈 江 杨柳明 赵延龙 崔 彬 王丽红

广东省廉江市人民医院肝病中心，广东廉江 524400

乙型肝炎病毒（HBV）X蛋白（HBx）是一个多功能调节蛋白，对于启动和维持HBV的复制是必须的，是HBV自然感染过程中的关键的调节因子；是HBV感染诱发肝细胞癌变的主要蛋白，故亦称癌蛋白。HBV相关肝癌多发生于男性的原因是和雄激素及雄激素受体（androgen receptor，AR）有关[1]。肝癌的发生常伴抑癌基因p53的改变[2]。本研究采用SP免疫组化方法检测三者在HBV相关肝癌中的表达及关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2000年2月～2010年5月廉江人民医院手术切除并经病理组织学检查确诊为HCC且有完整随访资料的标本58例，患者均未经过任何抗肿瘤治疗，HbsAg均为阳性。男46例，女12例；年龄23～86岁，中位年龄60岁；47例AFP≥400μg/L，11例 AFP＜400μg/L，39例肿瘤直径≥5cm，19例＜5 cm，TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期12例，Ⅲ～Ⅳ期46例。Edmondson-Steiner分级：Ⅰ～Ⅱ级6例，Ⅲ～Ⅳ级52例。伴有门静脉癌栓18例，腹腔淋巴结及远处转移9例。

1.2 试剂

HBx蛋白抗体及鼠抗人p53单克隆抗体及S-P试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。兔抗人雄激素受体抗血清购自Sigma公司。

1.3 免疫组织化学染色

采用SP免疫组织化学法检测HBx、AR及P53蛋白的表达，按试剂盒说明书操作步骤严格进行操作。用已知阳性组织切片做阳性对照，以PBS液做阴性对照。

1.4 结果判断

参照蒋成英等[3]的判断标准。阳性细胞计数：随机选择5个高倍视野，染色细胞＜5%计0分，5%～24%计1分，25%～49%计2分，50%～74%计3分，≥75%计4分。染色强度：细胞不着色计0分；浅黄色计1分；棕黄色计2分；棕褐色计3分。染色强度得分与阳性细胞计数得分相乘，0分为阴性，1～4分为弱阳性（+），5～8 分为中度阳性（++），9～12 分为强 阳性（+++）。

1.5 统计学方法

根据实验资料的性质，采用SPSS 13.0软件进行统计学分析，对所得资料进行χ2检验，相关分析采用Spearman等级相关系数，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HCC中HBx、AR及P53的表达

少数定位于细胞核（图1），AR阳性表达定位于细胞核（图2），P53阳性表达定位于细胞核及核膜上（图3）。HCC和癌旁组织中 HBx及 AR的表达率为 63.8%（37/58）、58.6%（34/58） 及 62.0%（36/58） 和 20.9%（12/58）、27.6%（16/58）及8.6%（5/58），差异有统计学意义（P ＜ 0.05）。

图1 HBx阳性表达（SP×200）

图2 AR阳性表达（SP×200）

图3 P53阳性表达（SP×200）

2.2 HCC中HBx、AR及P53表达的相关性

HBx阳性和HBx阴性的HCC组织中AR的表达率分别为 72.3%（27/37）、83.8（31/37）和 33.3%（7/21）、23.8（5/21），在HCC组织中HBx表达与AR表达正相关（r=0.453 2及r=0.475 4，P ＜ 0.05）。

2.3 HBx、AR表达与临床病理特征的关系

HBx染色的阳性率与AFP水平和分化程度相关；AR染色的阳性率与性别及肿瘤直径相关，p53染色的阳性率与TNM分期相关。见表1。

3 讨论

流行病学研究显示全世界80%以上的HCC与慢性乙型肝炎或丙性肝炎有关，由于病毒流行的地域不同，中国的HCC大部分是HBV相关性的，HBV相关HCC的显著特点是男性多发，与HCV感染者相比HBV感染者更容易发生HCC，研究者发现HBV的X蛋白与宿主肝细胞AR信号通路系统的相互作用是HBV相关HCC高发于男性的主要原因[4]。

HBx蛋白是多功能病毒调节因子，调控转录、细胞对基因毒性压力的应激反应、蛋白降解及信号通路，是肝癌发生过程中最重要的病毒因子[5]。在肝癌细胞株及HBx转基因小鼠的研究已经证明HBx可以增加AR的转录活性，离体研究表明HBx可以增加AR蛋白质的水平并且通过其蛋白体酶活性增加AR的稳定性。AR信号系统会增加肝细胞癌变的危险，AR可以被认为是一种癌基因，宿主细胞在癌变过程中AR转录活性的增加是主要原因，Zhu等[4]采用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、蛋白印记及免疫组织化学染色等方法检测HBV相关HCC及HBV阴性HCC中的AR表达发现，HBV相关HCC组织中AR的mRNA及蛋白表达均明显高于HBV阴性的HCC组织中的表达，转染HBx的L02及BEL-74004肝癌细胞株AR的表达明显升高，提示HBx通过刺激转录增加AR的表达。与本试验的结果相仿，表明AR在HBV相关HCC的发生中起作用。

近几年致癌作用中的表观遗传学改变备受关注，甲基化是表观遗传学改变的一种重要基因修饰方式，HBx蛋白是人肝细胞内主要的甲基化改变调节因子，在HBV诱发的肝癌发生早期HBx通过激活DNA甲基转移酶基因使抑癌基因启动子甲基化抑癌基因低表达。AR启动子CpG岛DNA的甲基化使AR在前列腺癌细胞及组织内的表达下降，而在HBV相关HCC组织中AR表达不伴其启动子甲基化，AR的甲基化状态与DNA甲基转移酶（DNMT）水平无关，HBV相关HCC组织中AR的表达及甲基化与前列腺癌不同，是组织特异性的[4]。

P53是最强的肿瘤抑制因子，在细胞应对各种应激反应时，P53相应的会诱导细胞周期阻滞或发生凋亡。在非应激状态下，P53受其负反馈调节因子MDM2（murine double mimute 2）蛋白的严密调控，P53激活MDM2基因的转录反过来MDM2蛋白又抑制P53的转录活性。在这种反射弧的调节下，P53及MDM2平时都维持较低水平，在应对应激时细胞内的P53水平增加导致下游靶基因的激活及P53通路系统的功能激活，发生细胞周期阻滞及凋亡[6]。P53对AR也具有调节作用，尽管P53控制AR的精确机制尚不明确，但P53基因的过表达通过抑制AR依赖基因的表达可以明显降低AR的功能[7]。生理水平的P53对雄激素信号系统有保护作用，当P53与AR基因的启动子稳定结合后雄激素信号系统的功能明显减弱，P53的负性调节因子MDM2也可以通过泛素依赖的蛋白降解作用调节AR蛋白水平[6]。

表1 临床病理特征与肝癌组织中HBx、AR及p53阳性表达的关系[n（%）]

HBV感染及男性是HCC发生的两个高危因子，HBV的HBx蛋白是肝癌发生过程中的始动因子，参与肝癌发生的一系列改变，包括AR系统的活化。雄激素及AR信号系统是宿主应答HBx作用的信号系统之一，另外，HBx可以导致P53通路介导细胞周期阻滞及凋亡抑制。本试验研究显示HBx表达与AR及P53显著中相关，该结果印证了三者的关系。三种蛋白在不同临床病理特征的HCC中的不同表达，提示三者在HCC发生发展的不同阶段起不同作用。国际多中心随机临床试验表明抗雄激素治疗对HCC疗效不明显，台湾学者Ming等[8]动物试验研究发现二甲氧基姜黄素（ASC-J9）可拮抗和降解雄激素受体，以抑制雄激素受体（AR）的表达，使AR的量减少，从而抑制HBV转基因小鼠肝癌细胞的增殖。MDM2拮抗剂Nutlin-3α是一种小分子化合物通过干扰P53-MDM2反射弧激活p53通路使野生型p53表达升高癌细胞凋亡，是一种增加野生型p53活性的抗治疗药物[6]，本试验肝癌组织中p53的阳性率为62.0%（突变型），p53突变与肝癌发生显著相关。肝癌是一种治疗手段有限的肿瘤，本试验研究表明HBx、AR及p53在肝癌发生发展中作用重要，针对这三个“靶点”综合治疗方案，如抗病毒（降低HBx水平）治疗加拮抗和降解雄激素受体治疗（ASC-J9）加MDM2拮抗剂可能成为HCC治疗的一种新思路。

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