不同提取水温对龙须菜多糖的得率、组成和免疫活性的影响

朱地琴，潘迎捷，唐庆九，张劲松，赵 勇

（1．光明乳业股份有限公司，乳业生物技术国家重点实验室，上海 200436；2．上海海洋大学食品学院，上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海 201306；3．上海农业科学院，食用菌研究所，上海 201403）

龙须菜Gracilariales lemaneiformis是我国重要的大型经济海藻之一，近年来已在山东、浙江、福建、广东和海南等省沿海进行大规模栽培[1]，对龙须菜进行深加工和高值化利用是龙须菜产业健康发展的重要保证[2－3]。利用龙须菜提炼琼胶是龙须菜传统的加工利用方法之一[3－5]，近年来的研究表明龙须菜多糖具有抗肿瘤、抗氧化和抗突变等多种生理活性，龙须菜多糖具有潜在的药用和保健价值[4,6－7]，这为龙须菜的加工增值提供了新的方向，因此，龙须菜多糖的研究和利用已引起人们的重视[8－14]。

有研究表明适当升高提取水温有利于提高龙须菜粗多糖的溶出率和琼胶的提取率[3,7]，但是过高的提取水温可能会降低海藻多糖的免疫或抗病毒活性[15]，因此，确定合适的提取水温对于龙须菜活性多糖的提取和利用具有十分重要的意义，然而迄今为止尚未见有关不同浸提水温对龙须菜多糖的生化组成和免疫活性的研究，这非常不利于龙须菜多糖的开发利用。另一方面，由于龙须菜粗多糖中含有较多的胶体，而粗多糖在冷冻后可分为胶体部分（soft－gelling fraction,SGF）和非胶体部分（non－gelling fraction,NGF），且胶体部分的免疫活性远低于非胶体部分[8]，因此，龙须菜活性多糖的开发利用应特别关注其非胶体部分。但是，目前龙须菜活性多糖的提取工艺中通常没有采用冻融步骤去除胶体[6－7,10－14]，这不仅降低了粗多糖活性，而且不利于活性多糖的分离和纯化（由于胶体具有很大的粘度）[15－16]。

鉴于此，本文系统研究了不同浸提水温对龙须菜非胶体多糖的得率、化学组成、免疫活性和抗病毒活性的影响，旨在为龙须菜多糖的研究和开发利用提供理论依据和实践参考，从而提高龙须菜的经济价值，促进龙须菜产业的健康可持续发展。

1 材料与方法

1.1 实验材料和前处理

实验用龙须菜采自广东汕头南澳岛，样品经上海海洋大学马家海教授鉴定。样品剔除杂质，用自来水洗净后采用冻干机冷冻干燥，粉碎后过100目筛，藻粉用塑料袋密封后置于干燥阴凉处保存。使用前在30℃条件下烘干48 h，冷却后称重再使用。

1.2 试剂和仪器

苯酚(重蒸)；D-半乳糖和植物凝集素（PHA）（Sigma公司）；BCATM蛋白测定试剂盒(Merck公司产品)；RPMI1640(Biochrom KG 公司)；RPMI1640、胎牛血清、青霉素和链霉素(GIBCO 公司)；Alamar Blue Assay(Biosource公司)；浓硫酸、95%乙醇等均为国产分析纯试剂；Balb/C小鼠购自中国科学院实验动物研究中心上海分中心。

离心机（Eppendorf 5810R，Beckman公司）、超低温冰箱（Thermo FORMAT25，Thermo Forma公司）、冻干机（Savant Thermo SNL216V，Thermo Savant公司）、T酶标仪（BIO-TEK synergy H）、电热恒温水浴锅（HH-S，上海医疗器械五厂）、分析天平（FA2004N，上海精密科学仪器有限公司）、旋转蒸发仪（Buchi公司）。

1.3 活性多糖的提取

分别称取龙须菜藻粉5 g左右，加入40倍重量的预热蒸馏水（预热到对应组的浸提水温），于30、40、50、60、70、80、90、100 ℃条件下浸提（共 8 个温度组），按文献[15]的方法，浸提前加稀盐酸调整悬浮液的pH为6.5，以保证浸提效果。浸提过程中每隔1 h用玻棒搅动浸提液，以便多糖充分溶出，根据预备实验结果，无论何种温度组，浸提4 h后粗多糖得率不再增加。因此，浸提4 h后取出浸提液冷却后离心（8 000×g，20 min），取出上清液后，加蒸馏水于离心管中再离心，如此反复2次，合并每个样品的上清液并混匀。按朱地琴等[8]的方法冻融除胶，上清液于-20℃条件下冷冻24 h，然后置于4℃条件下融化，融化液离心（12 000×g，30 min）后得到胶体和非胶体部分，取出非胶体部分在4℃条件下透析（截留分子量为10 000的透析袋），收集分子量大于10 000的部分进行冷冻干燥，既得龙须菜非胶体粗多糖，每个温度组重复4次。

1.4 实验方法

1.4.1 粗多糖溶出率和多糖含量测定

将1.3中的冷冻干燥后的粗多糖的胶体和非胶体部分进行准确称重,据此计算各自的溶出率。溶出率（%）=100×溶出部分冷冻干燥后的重量/干藻粉重量。采用苯酚-硫酸法测定多糖含量[17]，采用半乳糖作为标样并绘制标准曲线。

1.4.2 蛋白含量测定

采用BCA TM蛋白测定试剂盒（Merck公司产品）在T酶标仪上测定粗多糖样品的总蛋白含量，具体参照姚毓婧[18]的方法。

1.4.3 硫酸基含量测定

精确称取5 mg左右的粗多糖样品，加入1～2 mL的1 mol/L的盐酸，密封于玻璃管中在105～110℃条件下水解4～5 h，取0.2 mL的水解液加入到3.8 mL的3%三氯乙酸溶液(w/v)中，具体按照DODGSON和PRICE[19]的方法进行测定。

1.4.4 3,6-内醚半乳糖和半乳糖含量测定

参照YAPHE等[20]和张燕霞等[21]的方法，采用间苯二酚比色法测定3,6-内醚半乳糖的含量，采用蒽酮试剂测定3,6-内醚半乳糖和半乳糖的总含量，根据两者之间的差值计算出半乳糖的含量，采用分析纯的D-果糖和D-半乳糖作为标准制作标准曲线。

1．4．5 淋巴细胞免疫试验

按照朱地琴等[8]的方法进行淋巴细胞免疫试验。主要步骤如下：取小鼠脾脏用100目筛在培养皿中磨碎后离心（400×g，6 min），加入氯化氨溶液（浓度为 0．83%）裂解红细胞，静置 10 min 后 400×g离心 6 min，收集的细胞用PBS缓冲液冲洗数遍后，台朌蓝检查细胞活力在95%以上。用RPMI1640培养基将细胞稀释成2×106个/mL的悬浮液，取180 μL的悬浮液加至96孔板中，同时加入20 μL样品（样品包含空白对照PBS、阳性对照PHA和多糖样品），于37℃、含5%的CO2条件下培养3 d，测定其570 nm和600 nm处的吸光度，然后加入20 μL Alamar Blue试剂，再培养，变色后再测定570 nm和600 nm处的吸光度，然后根据Alamar Blue试剂的公式计算各种样品对细胞增殖的影响,计算公式如下。

增殖率(%)=〔80 856×Aλ570(sample)－117 216×Aλl600(sample)〕/〔80 856×Aλ570(control)－117 216×Aλl600(control)〕×100%

公式中的sample指的是多糖样品，control指的是空白对照PBS。

1．4．6 抗病毒试验

将冷冻干燥后的非胶体粗多糖送国家新药筛选中心检测其抗疱疹病毒Ⅰ和Ⅱ(HSV－Ⅰ和Ⅱ)活性，采用无环鸟苷（ACV）作为阳性对照药(湖北科益制药厂生产)，以Vero（非洲绿猴肾）细胞为病毒宿主，测定样品抑制疱疹病毒I、II型引起Vero细胞病变程度。具体步骤如下，将Vero细胞接种于96孔培养板，24 h后加入稀释后的样品及阳性对照药37℃培养2 h后分别感染疱疹病毒I型10－3（50倍TCID50感染量）、疱疹病毒II型10－4(30倍TCID50感染量)，吸附2 h，弃培养液,再按以上稀释度加入样品，同时设细胞对照孔和病毒对照孔，48 h观察细胞病变程度(CPE)，用Reed－Muench法分别计算样品对HSV－I、II型的半数抑制浓度（IC50）。

1．5 数据处理

利用SPSS11．5软件对实验数据进行处理，所有数据均采用平均值±标准差表示，用Levene’s法进行齐性方差检验，当不满足齐性方差时，对数据进行反正弦或者平方根转换，采用one－way ANOVA进行方差分析，Duncan’s法进行多重比较，取 P＜0．05 为差异显著，P＜0．01 为差异极显著。

2 结果与分析

2．1 不同提取水温对龙须菜非胶体粗多糖溶出率、总糖和蛋白含量的影响

由图1可知，不同提取水温对龙须菜非胶体粗多糖的溶出率影响显著(n=24，P＜0．01)，在 30～60℃提取水温时非胶体粗多糖的溶出率并没有显著差异，70℃时非胶体粗多糖的溶出率极显著低于其它各组(P＜0．01)，此后随着温度的升高非胶体多糖得率呈现上升趋势。不同温度组非胶体部分的多糖含量如图2，各组的多糖含量均在76%～90%之间，其中50℃和100℃组的多糖含量显著高于其它各组(n=3，P＜0．05)。不同提取水温对粗多糖中的蛋白含量影响显著，50℃组的蛋白含量最低，仅为(4．38±0．13)%，100 ℃组的蛋白含量高达(7．57±0．43)%(图 2)。

图1 不同提取水温条件下非胶体粗多糖的得率(%干藻粉)Fig．1 Effect of water－extracting temperature on the extraction rate of crude polysaccharide from red seaweed G.lemaneiformis(%dry seaweed powder)

图2 不同提取水温条件下粗多糖中的多糖含量(%干非胶体粗多糖)Fig．2 Effect of water－extracting temperature on the polysaccharide content of crude polysaccharide from red seaweed G.lemaneiformis(%dry non－gelling crude polysaccharide)

2．2 不同提取水温对龙须菜非胶体粗多糖中的硫酸基、3,6－内醚半乳糖和半乳糖含量的影响

不同提取水温对龙须菜非胶体粗多糖中的硫酸基含量有一定的影响(表1)，其中50、60、80和 100℃组的硫酸基含量显著高于40℃组。不同提取水温对龙须菜非胶体粗多糖中的3,6内醚半乳糖含量影响显著(n=18,P＜0．05)，70 ℃组的 3,6 内醚半乳糖含量最低，仅为(15．04±0．18)%，30 ℃组的3,6 内醚半乳糖含量显著高于其它各组，高达(20．02±0．58)%。就半乳糖含量含量而言，70和80℃组的含量仅为30%左右，显著低于其它各组，100 ℃组的含量高达(40．16±1．08)%。

图3 不同提取水温条件下粗多糖中的蛋白含量(%干非胶体粗多糖)Fig．3 Effect of water－extracting temperature on the protein content of crude polysaccharide from red seaweed G.lemaneiformis(%dry non－gelling crude polysaccharide)

表1 不同提取水温对龙须菜非胶体粗多糖中的硫酸基、3,6－内醚半乳糖和半乳糖含量的影响(%干非胶体粗多糖)Tab．1 Effect of water－extracting temperature on sulfate group,3,6－anhydro－galactopyranoseunit and galactopyranoseunit content of red seaweed G.lemaneiformis(%dry non－gelling crude polysaccharide)

2．3 不同提取水温对龙须菜非胶体粗多糖免疫活性和抗病毒能力的影响

表2为不同提取水温条件下龙须菜非胶体粗多糖的免疫活性，在同一温度条件下，粗多糖的免疫活性均随着多糖浓度的升高而显著升高；在同一粗多糖浓度条件下，不同提取水温对其免疫活性有显著影响，50℃水温组粗多糖的免疫活性达最大值，其中200 μg/mL和500 μg/mL两个剂量组的免疫活性明显高于阳性对照组的(189．93±13．41)%。此后随着提取水温的升高而显著降低，100℃水温组粗多糖的免疫活性均低于其它各组，仅为50℃的70%左右。各温度组非胶体粗多糖均没有检测出抗HSV－Ⅰ和Ⅱ活性。

表2 不同提取水温对龙须菜非胶体粗多糖免疫活性的影响Tab．2 Effect of water－extracting temperature on immune activity of non－gelling polysaccharides form red seaweed G.lemaneiformis

3 讨论

龙须菜富含海藻多醣、碘、钙、铁等多种人体必需的常量、微量元素和维生素A、B1、C等,先前的研究表明，经常食用龙须菜可以清肺通便、养颜瘦身、降血压血脂和调理身体机能等[1]。龙须菜不仅是重要的保健食品,而且是食品工业提炼琼胶的上等原料[2-3]。进一步的研究表明龙须菜多糖具有抗肿瘤、抗氧化和抗突变等多种生理活性[4-11]，因此对龙须菜进行深加工增值具有较大的开发潜力[1,7-8]。

尽管先前有部分关于龙须菜多糖提取工艺的研究报道[2-3,7-8,10-11]，尚未见不同提取水温对龙须菜非胶体多糖得率、理化性质和免疫活性影响的研究报道，这非常不利于龙须菜资源的深加工利用。尽管陈美珍等[7]研究表明90℃提取水温条件下，龙须菜得粗多糖溶出率较高，故建议90℃为龙须菜粗多糖得最佳浸提温度。但是由于上述研究中粗提物包括了胶体多糖和非胶体多糖,而胶体多糖的生理活性较低[8]，由于粗多糖中的胶体具有很大的粘度，非常不利于活性多糖的分离和纯化[15-16]。同时，先前的研究中没有考虑到不同提取水温对龙须菜多糖免疫活性的影响，仅以粗多糖溶出率为评价指标确定最佳提取水温[7]。因此，龙须菜活性多糖的提取应该考虑提取水温对提取物免疫活性及其组成的影响，同时采用冻溶工艺除去胶体，从而提高其免疫活性和药用价值[8,15]。鉴于此，本研究中在冻溶除胶的基础上，首先采用非胶体粗多糖的溶出率作为活性多糖得率的评价指标，系统研究了不同提取温度对于龙须菜活性多糖得率、理化性质和免疫活性的影响。

本研究结果表明，50℃提取水温时，龙须菜非胶体粗多糖的得率及其多糖含量较高(图1和图2)，而蛋白含量较低(图3)，当提取水温超过60℃时，非胶体粗多糖的得率显著下降，这是因为高温条件下胶体多糖的得率显著上升[3]。不管何种剂量组，50℃提取水温时，龙须菜非胶体粗多糖的体外免疫活性最高，随着提取水温的升高，其免疫活性呈下降趋势，这可能是因为高温条件下粗多糖中含有较多的蛋白等杂质，从而影响了其活性。此外，不同提取水温对多糖的结构和组成可能也存在一定的影响，从而影响其免疫活性[15,22]。先前的研究表明龙须菜活性多糖的主要由交替相连的（1→3）-β-D-半乳糖和（1→4）-α-L-3,6-内醚半乳糖重复二糖组成，分子量约为1.03×105Da[24]。此外，本研究所得非胶体粗多糖中3,6内醚半乳糖含量仅为16%～20%，这显著低于先前的研究报道[1,12]，这是因为本研究中采用冻融除胶工艺去除了胶体，而3,6-内醚半乳糖是胶体的主要成分[4,24]，故本研究中所得非胶体多糖中3,6-内醚半乳糖含量偏低。

多糖的免疫机制十分复杂，可以从免疫器官、免疫细胞和免疫分子各层次刺激巨噬细胞、淋巴细胞、T淋巴细胞、自然杀伤细胞、杀伤细胞和B细胞，增加他们的数量，从而增加他们的免疫活性[25]，如诱导人体淋巴细胞产生前列腺素，促进T淋巴细胞产生白细胞介素-2，激活淋巴因子等[27]。宫春宇等[9]研究表明龙须菜免疫活性多糖的主要为硫酸基多糖，且免疫活性和硫酸基含量呈正相关性，本研究结果表明，50℃提取组的硫酸基含量不仅显著高于40℃提取水温组，且高于其它各组，这可能是50℃提取水温组具有较高免疫活性的原因之一。

本研究结果表明龙须菜非胶体粗多糖的硫酸基含量在7%～10%，这与余杰等[1]和张昆等[12]的研究结果类似，在海藻中处于较高水平。有研究结果表明海藻多糖中的硫酸根含量的高低可能与其抗病毒活性具有一定的相关性[12,15]。尽管本研究中各组非胶体多糖的硫酸基含量均较高，但是他们并没有表现出抗病毒活性，这可能和多糖中硫酸基的位置有关，同时多糖中甲氧基位置同样也会影响海藻多糖的抗病毒活性[22]。迄今为止，在特定条件下提取的红藻多糖绝大多数均具有抗病毒活性[22-23,27]，而本实验条件下的龙须菜非胶体粗多糖并没有表现出抗病毒活性(抗HSV-Ⅰ和Ⅱ)，这可能和我们的提取工艺有关，尽管水提方法操作简单、成本低廉[8]，但由于水提法所得的粗多糖中含有较多的蛋白和矿物质元素，这可能会影响多糖的抗病毒活性，因此PONCE等[27]建议首先采用70%的乙醇尽量去除海藻中的蛋白和矿物质离子，这样可以得到活性较高的海藻多糖。

4 结论

不同提取水温对龙须菜非胶体粗多糖的得率、多糖含量、蛋白含量、硫酸根含量、3,6内醚半乳糖、半乳糖含量和免疫活性影响显著。50℃提取水温时，龙须菜非胶体粗多糖的得率、硫酸基含量、体外免疫活性较高，蛋白含量较低；当提取水温超过60℃时，非胶体粗多糖的得率和免疫活性显著下降，蛋白含量显著上升。因此，龙须菜免疫活性多糖的最佳提取水温建议为50℃。

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