岷山红三叶草异黄酮合酶基因的克隆及序列分析

胡焕焕，刘 瑞，姬国杰，李卫东，丰慧根，*

(1.新乡医学院生命科学技术系，河南新乡 453000;

2.新乡医学院三全学院，河南新乡 453000)

岷山红三叶草异黄酮合酶基因的克隆及序列分析

胡焕焕1，刘 瑞2，姬国杰1，李卫东1，丰慧根1，*

(1.新乡医学院生命科学技术系，河南新乡 453000;

2.新乡医学院三全学院，河南新乡 453000)

从岷山红三叶克隆异黄酮合酶基因，并对序列进行比对和进化分析。建立岷山红三叶愈伤组织培养体系，采用RT－PCR扩增从愈伤组织总RNA中分离了异黄酮合酶基因，并将其克隆到pGEM－T Easy载体，测序，得到全长1575bp的片段。序列分析表明，异黄酮合酶基因含1575个核苷酸，和大豆等其他植物中异黄酮合酶具有很高的同源性。

岷山红三叶，异黄酮合酶，基因克隆，序列分析

岷山红三叶产于甘肃省岷县，也称红车轴草，是著名珍稀的高产优质牧草。1944年由美国引进，在岷县已有60余年的种植历史，经多年的选育、驯化，成为当地的优势草种。1987年经全国饲料牧草品种审定委员会审定登记并命名为岷山红三叶，被誉为中国第一草［1］。岷山红三叶中异黄酮含量是1.0%～2.6%，是大豆异黄酮含量的8～10倍［2］。其提取物异黄酮类的主要成分是芒柄花素、鹰嘴豆牙素、异黄酮、染料木素、染料木甙、大豆甙元、大豆甙等，其中鹰嘴豆牙素A和芒柄花素含量最高［3］。并且含有大豆所没有的异黄酮—鹰嘴豆芽素A、B(被誉为“女性生命素”)，而且比大多数异黄酮的雌激素样活性高。红三叶异黄酮作为天然植物雌激素是深受国际市场欢迎的健康食品。研究表明，红三叶异黄酮能调整人体内分泌，使皮肤细腻富有弹性;有效预防骨质疏松，改善睡眠，对女性更年期综合症及其他因雌激素下降引发的各种疾病，具有独特的功效，又被称为“女子魅力因子”［4］;能降低血脂、预防冠心病、止痛消肿、抗感染、保护神经系统、延缓衰老等;同时异黄酮还是一种潜在的抗癌物质，对结肠癌、乳腺癌等有防治作用。异黄酮的合成源自类黄酮生物合成途径中生成的中间代谢产物黄烷酮。催化黄烷酮进入异黄酮合成途径的第一步反应酶为异黄酮合酶，是异黄酮合成途径的关键酶［5－6］。为利用异黄酮的生物学功能，本实验采用RT－PCR方法克隆岷山红三叶全长cDNA，对序列进行比对分析，为进一步研究植物异黄酮的生物合成以及进行异黄酮生物工程研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

岷山红三叶(Trifolium Pratense Minshan);宿主菌Escherichia coliDH5α 为本实验室保存;T载体pUGM－T Easy Promege公司;限制性内切酶EcoRⅠ、Taq酶 NEB公司;DL2，000TMDNA Marker、DL10，000TMDNA Marker、PrimeScript RT－PCR Kit、Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0、MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0、RNAiso－mate for Plant Tissue、RNAiso Plus(Total RNA提取试剂) 大连宝生物。

梯度PCR扩增仪C1000 Bio－Rad Laboratory;电泳仪DYY－2 北京市六一仪器厂;Touching 956数码相机凝胶成像系统 上海天呈科技有限公司;高速冷冻离心机Neofuge 23R 上海力申科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 愈伤组织培养体系的建立

1.2.1.1 无菌外植体的制备 选择无病斑，籽粒饱满，颜色均一的红三叶种籽，脱毒，种籽在自来水下冲洗20min，用75%的乙醇浸泡1min，5%有效氯浓度次氯酸振荡清洗20min，无菌水冲洗三次，每次不少于两分钟，滤纸吸干水分，播种在不添加激素的MS+10g蔗糖+6%琼脂的培养基上，16h光照，8h黑暗，25℃，培养一周。

1.2.1.2 愈伤组织的诱导 分离幼苗子叶和下胚轴，将下胚轴切成5mm长的小段，子叶切成两瓣，分别接种于MS+20g/L蔗糖+0.6%琼脂的基本培养基，添加2mg/L 2，4－D，0.5mg/L 6－BA［7］。(25±2)℃，暗培养。每隔一周观察一次，记录生长情况。

1.2.1.3 愈伤组织的继代培养 诱导出的愈伤组织继代培养条件为，MS+0.5mg/L 6－BA+0.5mg/L 2，4－D，每隔一周观察并记录一次。

1.2.2 引物的合成和总RNA的提取 依据GeneBank的异黄酮合酶序列(AY253284.1)［8］设计引物，由Invitrogen公司合成。

同 源 引 物:IFSHONG1 5'ATGTTGTTAG AAATTGCAGTTGC3';

互补引物:IFSHONG25'TTAAGAGGAAA GGAGTTTAGCTG3';

取生长状态良好的愈伤组织提取总RNA:取继代一次，生长稳定的岷山红三叶愈伤组织一块(约300mg)，在液氮中研磨至粉末状，加入1mL植物组织RNA提取辅助剂，继续研磨至裂解液透明，迅速转入1.5mL Eppendorf管，12000r/min 4℃ 离心5min;小心吸取上清液平均分至2个新的1.5mL Eppendorf管，各约500μL;各加入500μL的RNAiso Plus振荡混匀，静置5min;随后加入200μL氯仿，剧烈振荡15s，静置5min;12000r/min 4℃离心15min;吸取上清转移至另一新的离心管中;加入等体积的异戊醇，上下颠倒混匀后，室温静置10min;12000r/min 4℃离心10min;小心弃去上清，沿管壁缓慢加入1mL 75%乙醇，轻轻上下颠倒离心管，12000r/min 4℃离心5min后弃去上清;室温干燥5min;加入40μL的Rnasefree水溶解。－80℃保存，备用。

1.2.3 反转录与PCR反应 采用两步RT－PCR法，反转录:总RNA 1μL，Random 6 mers 1μL，dNTP 1μL和Rnase Free dH2O 7μL，反应:65℃ 5min，4℃保存;向上述反应液添加5×Prime Script Buffer 4μL，Rnase Inhibitor 0.5μL，PrimeScript Rtase 0.5μL，Rnase Free dH2O 5μL，反应:30℃ 10min，42℃ 20min，75℃ 15min，4℃保存;以岷山红三叶cDNA为模板，扩增IFS基因，PCR反应体系包含:10×PCR BufferⅡ2.5μL，dNTP Mixtuer 1μL，IFSHONG1、2各 0.5μL，TaKaRa Ex Taq HS 0.25μL，反转录反应液2.5μL和Rnase Free dH2O 17.75μL补足25μL;反应程序如下: 94℃变性30s;58℃退火30s;72℃延伸90s(10个循环，每个循环退火温度下降1℃);94℃变性30s;48℃退火 30s;72℃延伸 90s(25个循环);72℃终延伸5min。

1.2.4 PCR产物的回收、克隆与序列分析 PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析并纯化回收，按照TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0说明书操作。按PCR产物克隆试剂盒说明将回收片段与pUGM－T Easy载体连接，转化E.coliDH5α，在添加Amp、IPTG、X－gal的LB平板上挑取白色菌落。提取质粒DNA后，经限制酶酶切和PCR扩增，选择有正确插入片段的克隆，测序。

2 结果与分析

2.1 IFS基因的克隆

PCR产物电泳结果分析表明，扩增得到约1.6kb的片段，与实验设计要扩增的片段大小相符(图1)。

图1 PCR产物Fig.1 Product of PCR

2.2 重组质粒的筛选和鉴定

PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分析并纯化回收，与pUGM－T Easy载体连接，转化E.coli DH5α后，挑选白色菌落。提取质粒DNA，经限制酶酶切和PCR扩增验证，得到约1.6kb片段，与实验设计要扩增得到的片段大小相符(图2)。

图2 重组质粒的限制酶切及图谱Fig.2 Restriction and PCR amplification map of recombination plasmid

2.3 IFS基因的序列比对分析

克隆产物经正反两向测序后，拼接结果表明，IFS基因全长1575个碱基，通过Blast与Genbank分析，与已报道的红三叶异黄酮合酶基因(AY253284.1)的核苷酸同源性为99%(图3)。同时分析结果表明和其他植物(大豆、蒺藜苜蓿、三野葛、鹰嘴豆等)中异黄酮合酶相比有很高的同源性。氨基酸水平同源性为75%～80%，相似性高达92%～97%。与白三叶，紫花苜蓿和绿豆等中异黄酮合酶更有高达95%～99%的同源性(图4)。系统发生分析表明红三叶异黄酮合酶最接近蒺藜苜蓿(图5)。

图3 岷山红三叶IFS序列Fig.3 Sequence of IFS from Trifolium Pratense Minshan

图4 红三叶异黄酮合酶氨基酸序列和其他植物异黄酮合酶的多重序列比对Fig.4 Multiple sequence alignment of IFS－Tp and plant IFS proteins

图5 系统发生树分析Fig.5 Phylogenetic analysis of other plant IFS

3 讨论与结论

从第一例转基因烟草的出现，转基因技术飞速发展，今天它不仅仅是传统育种的辅助手段，也是植物生物技术和品质改良的核心。由于红三叶种质资源有限，并且与野生型的种质具有不相容性［9］，使得利用转基因技术对红三叶草进行品种改良至关重要。目前国内外研究三叶草多侧重于将外源基因导入三叶草基因组，而对三草叶本身具有重要应用价值的基因研究较少。

杜邦公司在2000年首次将大豆IFS基因转入模式生物拟南芥，并在叶片和茎中检测到IFS的表达，染料木素含量是2μg/g［10］。Bong Gyu Kim等［5］将红三叶IFS基因转化酵母，重组酵母微粒体可以将柚皮素转化为染料木素。红三叶中IFS基因是单拷贝，如果将克隆的IFS片段通过植物表达载体转回红三叶基因组，理论上会提高红三叶中IFS的拷贝数，从而提高异黄酮的产量。

本文通过PCR方法，从岷山红三叶的愈伤组织中克隆了异黄酮合酶基因(IFS)，该基因全长1575个核苷酸，编码525个氨基酸，与已报道的红三叶异黄酮合酶基因核苷酸同源性99%。该基因的克隆为下一步将IFS基因导入红三叶，改良红三叶草种质，提高红三叶的药用价值创造了条件，为研究植物异黄酮的生物合成以及进行异黄酮生物工程研究奠定基础。

［1］贾学辉，李保财.岷山红三叶小草大产业［OL］.http:// www.gsei.com.cn/.2010.

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Cloning and sequence analysis of isoflavones synthase gene fromTrifolium Pratense Minshan

HU Huan－huan1，LIU Rui2，JI Guo－jie1，LI Wei－dong1，FENG Hui－gen1，*
(1.Life Science and Technology Department，Xinxiang Medical University，Xinxiang 453000，China;
2.Sanquan Medical College Xinxiang Medical University，Xinxiang 453000，China)

For making good use of the specific biological function of isoflavone.A cDNA fragment from full length IFS gene was amplified by polymerase chain reaction from total RNA of callusTrifolium Pratense Minshan，and it was sequenced after cloned into pGEM－T Easy vectors.A cDNA fragment of 1575bp from full length IFS gene was got.The sequencing results indicated that the cloned fragment of IFS contained 1575 nucleotides，and shared a sequence homology of 99%with that from Genbank accession.

Trifolium Pratense Minshan;isoflavone synthase;gene cloning;sequence analysis

Q943.2

A

1002－0306(2012)21－0178－03

2012－04－18 *通讯联系人

胡焕焕(1987－)，女，硕士研究生，研究方向:生物制药。

河南省科技厅重点支持项目(102102310189);河南省教育厅立项项目(2009A180014);新乡医学院研究生科研创新支持项目(YJSCX201116Y)。