纳米硒-壳聚糖复合物缓释作用研究

2012-10-25 01:10吴永军
食品工业科技 2012年22期
关键词:消化液复合物回归方程

吴永军

(马鞍山师范高等专科学校理工系,安徽马鞍山 243041)

纳米硒-壳聚糖复合物缓释作用研究

吴永军

(马鞍山师范高等专科学校理工系,安徽马鞍山 243041)

以盐酸羟胺、亚硒酸为反应物,食品级海藻酸钠为软模板,制备了分散性良好的红色无定形纳米硒。辅以壳聚糖、玉米淀粉,合成出了纳米硒-壳聚糖复合颗粒,在模拟消化液中研究了复合物的硒缓释行为,考察了模拟消化液pOH、缓释温度、缓释时间对硒释放率的影响。结果表明,含硒复合物适合于缓释,最佳缓释条件为:模拟消化液pOH= 12.80,缓释温度38℃,缓释2.8h,纳米硒-壳聚糖复合物的硒释放率达到68.43%,实测结果与模型预测值的相对误差仅为0.48%。

纳米硒,壳聚糖,缓释,响应面分析

1817年,瑞典化学家Berzelius J J从硫酸工厂铅室内的沉积物中分离出硒元素。硒具有清除自由基、增强免疫、调节代谢、抗肿瘤、预防疾病等重要的生物学活性[1-5]。WHO于1973年宣布硒是人体必需的微量营养元素。1988年,中国营养学会也将硒列为15种每日膳食营养素之一。我国是缺硒大国,70%的国土面积缺硒[6],数亿人口生活在缺硒地区,成年人硒的日摄入量远低于推荐供给量[7],因此大多数人需要补充硒元素,补硒制剂具有广阔的市场前景。目前的硒源主要有:无机硒(硒酸盐和亚硒酸盐)、有机硒(硒蛋白、硒代氨基酸)、纳米硒(α-Se、t-Se)。相比之下,无定形红色纳米硒(α-Se)具有突出的低毒高效性[8],较之晶态纳米硒(t-Se)更易于分散,溶解性能更好,是补硒强化剂的理想硒源。自1994年张劲松、高学云博士率先研制出纳米硒之后,关于纳米硒的应用研究主要集中在光电子方面,鲜有利用纳米硒开展补硒的研究。笔者已开展过利用纳米硒进行小白菜补硒的研究[9]。另一方面,壳聚糖(chitosan)具有良好的降解性、透过性,且安全无毒等众多的优点,是一种优良的缓释材料[10],被广泛应用于食品、医药、农业等多学科领域。本研究利用自制的水溶性壳聚糖[11]合成纳米硒-壳聚糖复合物并进行硒缓释作用的研究,希望对补硒制剂的开发与应用提供有益的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

SeO2、99.99%高纯硒粉 西亚化工有限公司;盐酸羟胺、25%戊二醛 国药化学试剂有限公司;硝酸、盐酸、氢氧化钠、苯 均为AR,南京化学试剂有限公司;食品级海藻酸钠、95%酒精、水溶性壳聚糖[10]、玉米淀粉(一级) 南京雨润;去离子水、蒸馏水。

日立Hitachi S-4800型扫描电镜 日本;Y-4Q型X射线衍射仪 丹东射线仪器厂;DZF型真空干燥箱金坛汉康电子有限公司;PS-10AL型超声清洗仪 上海之信仪器有限公司;HHS-21-4型恒温水浴锅、79-1型磁力搅拌器 金坛新航仪器厂;TGL-16C型离心机 常州中捷实验仪器有限公司;FA1104型分析天平 上海舜宇恒平科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 纳米硒的制备 称量2.774g SeO2和0.250g海藻酸钠,分别用蒸馏水定容至500m L,配制0.05mol/L的H2SeO3溶液和0.5g/L的海藻酸钠溶液。移取20m L 25%戊二醛溶液,以蒸馏水定容至100m L,配制成5%戊二醛溶液,用于下述实验。

移取20m L 0.1mol/L的NH2OH·HCl溶液注入一只干燥清洁的250m L烧杯中,加入一定量的0.5g/L海藻酸钠溶液后摇匀,用移液管加入10m L 0.05mol/L的H2SeO3溶液,n(NH2OH·HCl)∶n(H2SeO3)=4∶1,以盐酸羟胺还原亚硒酸,海藻酸钠大分子充当软模板分散控制硒纳米晶生长,快速摇匀后置于恒温水浴锅中分别于50、80℃下加热1h,制得纳米硒产物。

1.2.2 纳米硒-壳聚糖复合物的制备 按1.2.1实验方法,先制备红色α-Se。产物经去离子水清洗一次,静置后倒去红色沉淀上方清液。随后,加入100m L蒸馏水、10.0g壳聚糖作为缓释剂、2.0g玉米淀粉作为粘结剂、崩解剂。以500r/m in的转速磁力搅拌1h后形成均一稳定的浅红色悬浊液,再加入5m L 2%戊二醛溶液,继续搅拌10m in后将混合液倒入药粒模具内,置于冰箱冷冻室中,-4℃下冷冻5h后制得40粒浅红色药粒。药粒取出后用纯净水快速冲洗1遍,40℃下真空干燥2h,最后获得浅红色含硒药粒成品。

1.2.3 缓释研究 将浓盐酸稀释后辅以氢氧化钠配制一定酸度(以pOH表示)的模拟消化液500m L。将一颗含硒药粒投入装有500m L模拟消化液的烧杯中,置于恒温水浴里,通过一定时间内硒含量测定来折算释放率,研究其缓释行为。考察不同pOH消化液、缓释时间、温度对纳米硒-壳聚糖复合物缓释作用的影响。测量模拟缓释液中硒含量时,每次取1m L缓释液,以邻苯二胺紫外分光光度法[11]测定其中硒的紫外吸收,同时补充1m L同温度下的同pOH空白液回缓释体系。

1.2.4 标准曲线的绘制 标准硒液配制:称取高纯硒粉0.0200g,以10%稀硝酸溶解、定容至100m L,从中吸取10.00m L,定容至1000m L,获得浓度为2μg/m L的标准硒液。分别吸取硒标准品溶液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00m L置于分液漏斗中,折合含硒量为2、4、6、8、10、12μg。以邻苯二胺紫外分光光度法[12]测定样本吸光度,硒标液在200~400nm波长范围内扫描,335nm处存在最大吸收峰。故而以紫外分光光度计在335nm波长下测样品吸光度A,以未加入复合缓释物的模拟消化液为空白对照,绘制出标准硒曲线。以吸光度对硒含量进行回归,解算回归方程。

1.2.5 样品硒含量与硒释放率 采集不同实验条件下的缓释液样本,置于分液漏斗中,按1.2.4中方法,以空白模拟消化液的苯萃取液为参照,分别测定样本的吸光度,利用回归方程解算含硒量,进而折算硒

释放率,如式(1)所示。

1.2.6 单因素实验 通过前期研究,发现影响复合缓释物硒释放率的主要影响因素有:模拟消化液pOH、缓释温度、缓释时间。这三者作为考察因素,以硒释放率作为评价指标,进行单因素实验。

1.2.6.1 模拟消化液的pOH对复合物缓释作用的影响 将装有模拟消化液的烧杯放入37℃恒温水浴中,缓释时间为1h时,考察纳米硒-壳聚糖复合物在不同pOH的模拟消化液中的释放效果。由于人体胃液中消化液的pH约为1.2,小肠消化液的pH约为6.8,其他体液(血液、淋巴等)则偏碱性,故而选用缓释液的pH范围:1.2~12.4(以胃液pH为酸度上限),对应的pOH范围为:1.6~12.8。

1.2.6.2 缓释温度对复合物缓释作用的影响 当模拟消化液pOH为12.8、缓释时间为1h时,将缓释体系置于恒温水浴中,考察纳米硒-壳聚糖复合物在不同温度(30~55℃)的模拟消化液中的释放效果。

1.2.6.3 缓释时间对复合物缓释作用的影响 当模拟消化液pOH为12.8、水浴温度为37℃时,考察纳米硒-壳聚糖复合物浸没于模拟消化液不同时间(0.5~ 7h)后的释放效果。

1.2.7 中心组合实验设计 根据Box-Benhnken实验原理,结合上述单因素实验结果,以模拟缓释液pOH值(A)、缓释温度(B)、缓释时间(C)这3个因素构建响应面实验,因素水平如表1所示。

表1 纳米硒-壳聚糖复合物缓释作用响应面分析试验设计因素与水平表Table 1 Factors and levels of response surface analysis experiment

2 结果与分析

2.1 纳米硒的表征

按1.2.1实验方法制得高分散性产物经SEM检测,如图1、图2所示。

图1 50℃产物的SEM(80000×)Fig.1 SEM image of the products synthesized under 50℃(80000×)

图2 80℃产物的SEM(40000×)Fig.2 SEM image of the products synthesized under 80℃(40000×)

将该反应产物依次经由去离子水、工业酒精各超声清洗2遍,自然干燥后制成纳米粉体,在10°≤2θ≤80°范围内用X射线衍射表征,产物的XRD如图3、图4所示。衍射数据经与JCPDS卡对比,发现80℃下获得是三方相晶态的t-Se(灰褐色),50℃下获得是非晶的α-Se(红色)。由于红色α-Se具有广泛的生物活性,溶解性良好[13],因此选择其作为硒源制备纳米硒复合物,开展缓释实验。

图3 50℃产物的XRDFig.3 XRD image of the products synthesized under 50℃

图4 80℃产物的XRDFig.4 XRD image of the products synthesized under 80℃

2.2 标准曲线

图5 硒标准曲线Fig.5 Standard curve of Selenium

由1.2.4步骤中测算出6个不同样本在335nm下的吸光度,显示样本线性良好,如图5所示。推算出吸光度A对缓释样本硒浓度的回归方程A=0.0148C-0.0323(N=6),r2=0.9941,线性范围:2~12μg。

2.3 单因素实验

2.3.1 模拟消化液的pOH对复合物缓释作用的影响单因素实验结果如图6所示。随着模拟消化液pOH的上升,模拟液中的硒含量逐渐增大,pOH大于10以后,硒释放率增长缓慢。以上实验现象可以通过溶液pH对复合物基质的影响加以解释。杨明世等[14]研究表明,酸性环境有助于玉米淀粉的崩解速度的提高;邵丽等[15]报道了壳聚糖缓释微球在pH<7.4溶液中的释放速度明显大于碱性溶液,且释放速度与溶液的酸度呈正相关。可见,模拟消化液酸性增加,有助于其中的缓释剂与崩解剂的崩解释放,进而提高复合物中硒的释放率。由以上实验结果,将模拟消化液的pH设定为1.2~6.8,对应的pOH为7.2~12.8。

图6 模拟消化液pOH对复合物缓释作用的影响Fig.6 Effect of the pOH of simulation digestive juice on the sustained-release profile of complex

2.3.2 缓释温度对复合物缓释作用的影响 单因素实验结果如图7所示。30~50℃范围内随着模拟消化液温度的上升,缓释体系中含硒量不断上升,但达到40℃以上时,增速减小;超过50℃后,含硒量开始逐渐降低。李德海等[16]通过研究发现,温度上升会加速玉米淀粉的糊化。出现图7所示这种现象的原因在于作为控释剂的壳聚糖与作为崩解剂的玉米淀粉在升温后逐渐糊化[17],糊化物难溶于水,其包裹在纳米硒-壳聚糖复合物表面,抑制了纳米硒的释放。由以上实验结果,参考人体正常的温度范围,设定缓释温度为35~39℃。

图7 缓释温度对复合物缓释作用的影响Fig.7 Effectof the sustained-release temperature on the sustained-release profile of complex

2.3.3 缓释时间对复合物缓释作用的影响 当模拟消化液pOH为12.8、水浴温度为37℃时,考察纳米硒-壳聚糖复合物浸没于模拟消化液不同时间(0.5~7h)后的释放效果。实验结果如图8所示。可见,随着缓释时间的延长,缓释体系中硒的释放率逐渐上升,但增速逐渐减小。释放过程存在明显的突释(<3h)与缓释(>3h)两个时期,其释放机理大致为:复合缓释物投入水中后,颗粒外表面吸水,壳聚糖与玉米淀粉开始溶胀,短时间内大量纳米硒通过破裂的外壁释放出来,此过程为突释期;此后,外层的壳聚糖溶胀后糊化包裹在复合缓释颗粒的外层,内部的纳米硒必须通过缓慢的扩散才能突破表面糊化层而释放出来,极大降低了硒的释放速率。同时,溶液中已经存在的纳米硒会抑制复合缓释颗粒中纳米硒的继续释放[18]。两种效应叠加起来,促成了“缓释期”。依据上述实验事实,参考混合食物在胃部的停留时间,设定缓释时间为2~4h,用于以下分析。

图8 缓释时间对复合物缓释作用的影响Fig.8 Effectof the sustained-release time on thesustained-release profile of complex

2.4 利用响应面分析法确定最优缓释条件

2.4.1 响应面实验设计及结果如表2所示,其中1~5号是中心实验,6~17号为析因实验,中心实验重复5次以评估实验误差。

表2 响应面实验设计方案及实验结果Table 2 Experimental design and results of the Box-Benhnken test

2.4.2 建立拟合模型与方差分析 对表2中3个影响因素A、B、C的数值及硒的释放率利用Design Expert 7.1.6软件进行回归分析,得出回归方程及方差分析

表,详见式(2)、表3。

表3 回归方程的方差分析Table 3 ANOVA for the regressionmodel

由表3可知:回归方程的显著性相当明显,A、B、C、BC、A2、B2、C2极显著,AC显著,AB不显著,分析结果表明,上述影响因素对复合缓释物中硒释放率具有不同的交互影响作用。回归方程的R2=0.9926,模型与实际实验具有良好的拟合性,实验中失拟项较小,回归方程满足实验分析要求。

2.4.3 响应面分析 分别将模拟缓释液pOH、缓释温度、缓释时间三个因素两两为自变量,以硒释放率为响应指标做出响应面,考察各因素间的交互作用对纳米硒复合物释放率的影响,如图9~图11所示。其中,缓释温度与缓释时间的交互作用对复合物硒释放率的影响(图11)极为显著(p<0.01),其响应面曲线较陡;模拟缓释液pOH与缓释时间之间交互作用(图10)显著(p<0.05);模拟缓释液pOH与缓释温度之间交互作用(图9)不显著(p>0.05)、曲线较为平滑。

图9 模拟消化液p OH和缓释温度的交互作用对硒释放率影响的响应面Fig.9 Response surface plot of the pOH of simulation digestive juice and the sustained-release temperature on the yield

图9是模拟消化液pOH和缓释温度交互影响复合缓释物硒释放率的响应面。由图9可见,当模拟消化液pOH不变时,随缓释温度的升高,硒释放率先增加后小幅减小,在38℃左右硒的释放率达到最大;缓释温度不变,硒释放率随模拟消化液pOH增大而呈小幅上升趋势,响应曲面比较平滑,增大pOH,有助于提高复合物的硒释放率。

图10 模拟消化液pOH值和缓释时间的交互作用对硒释放率影响的响应面Fig.10 Response surface plotof the pOH of simulation digestive juice and the sustained-release time on the yield

图10是模拟消化液pOH与缓释时间交互影响复合缓释物硒释放率的响应面。由图10可见,当模拟消化液pOH不变时,随缓释时间的延长,纳米硒-壳聚糖复合物的硒释放率先逐渐增大,接近3h时释放率最大;缓释时间不变,随着模拟消化液pOH增大,复合物的硒释放率明显增大,响应面陡峭,pOH=12.8(pH=1.2,相当于胃液pH)时达到最大释放率。

图11 缓释温度和缓释时间的交互作用对硒释放率影响的响应面Fig.11 Response surface plotof the slow-release temperature and the sustained-release time on the yield

图11是缓释温度与缓释时间交互影响复合物硒释放率的响应面。由图11可见,缓释温度不变,随缓释时间的延长,纳米硒-壳聚糖复合物的硒释放率逐渐增大,增幅逐渐减小;缓释时间不变,复合物的硒释放率随缓释温度的增大,先快速增大之后缓慢减小,响应曲面比较陡。最大释放率出现在3h多一点。实验表明,缓释温度与缓释时间这两个因素交互作用显著,与模型的方差分析结果一致。

通过Design Expert 7.1.6对拟合模型进行响应面分析,获得纳米硒-壳聚糖复合物的最优缓释条件:模拟消化液pOH=12.8(pH=1.2),缓释温度38.17℃,缓释2.84h,纳米硒-壳聚糖缓释复合物的硒释放率可达到68.76%。鉴于实际操作的可行性,将实验条件修正为:模拟消化液pOH=12.8(pH=1.2),缓释温度38℃,缓释2.8h。使用以上条件重复3次平行实验,计算平均硒释放率为68.43%,与模型预测值的相对误差为0.48%,说明本研究通过响应面法获得的缓释条件是准确可靠的。

3 结论

本研究利用盐酸羟胺还原二氧化硒,以食品级海藻酸钠为软模板,低温水浴快速制备粒径小、高分散的无定形态纳米级α-Se;以此作为安全硒源,添加在壳聚糖、玉米淀粉中制备出了纳米硒-壳聚糖缓释复合物。通过体外模拟人体缓释实验,考察了模拟消化液pOH、缓释温度、时间等因素对复合物缓释作用的影响,初步探讨了其释放机理,借助响应面分析法获得了纳米硒-壳聚糖复合物在模拟消化环境中的最优缓释条件。由于在复合缓释物制备过程中清洗、脱模等工序会造成的纳米硒损失,以及模拟人体中的消化缓释环境的制约,所以硒释放率的峰值无法达到100%,研究中响应面分析也证实了这一结果。

整个实验设计简单、原料易得、三废污染少、经济性高,产品具有突出的低毒、高效性。由于人体的消化是一个非常复杂的过程,纳米硒-壳聚糖缓释复合物在人体中的实际释放行为会与本模型存在一定的差异,但以上研究表明,纳米硒-壳聚糖复合物在整个药效期内释放量比较平稳,突释短、缓释长,其可作为一种新型的补硒缓释制剂,在食品、医疗、保健等研究领域具有广阔的应用前景。

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Study on the sustained-release profile of nano selenium chitosan com posite

WU Yong-Jun
(Science&Technology Department,Maanshan Teacher’s College,Maanshan 243041,China)

High scattered red amorphous nano selenium was synthesized in the p resence of food-grade sodium alginate,emp loying SeO2and NH2OH·HCl as the reactants.Then Nano selenium/chitosan com posite partic les were synthesized by com pound ing Nano selenium w ith chitosan and corn starch.The selenium sustainedrelease behavior of comp lex had been studied in simulation digestive juice,some fac tors influencing the release rate of selenium were systematically investigated,such as the pOH of simulation d igestive juice,the sustained-release temperature and time.Experiments showed that Nano selenium com p lex was fit for slowrelease.The op timal sustained-release conditions as follows:the pOH of simulation digestive juice was 12.8,sustained-release temperature was 38℃,sustained-release time was 2.8h.Under the cond ition,the release rate of selenium was up to 68.43%.The analysis capability of model was significant as the relative error between experimental resultand modelp red icted value was 0.48%.

nano selenium;chitosan;sustained-release;response surface analysis

TS202.3

A

1002-0306(2012)20-0141-05

2011-12-03

吴永军(1978-),男,硕士,副教授,研究方向:功能材料、食品工程。

2010年安徽省高校省级自然科学研究项目(KJ2010B221)。

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