GPC-HPLC-FLD法测定动植物油脂中的苯并(a)芘

马君刚，张煌涛，于 红，任水英*

(国家农副产品监督检验中心(新疆)，新疆 乌鲁木齐 830004)

GPC-HPLC-FLD法测定动植物油脂中的苯并(a)芘

马君刚，张煌涛，于 红，任水英*

(国家农副产品监督检验中心(新疆)，新疆 乌鲁木齐 830004)

建立动植物油脂中苯并(a)芘残留量的凝胶净化-高效液相色谱-荧光检测的测定方法。方法采用凝胶色谱净化系统处理样品，可除去油脂中甘油三酯等杂质的干扰。色谱条件：Hypersil ODS2(150mm×4.6mm，5μm)反相色谱柱，流动相为甲醇-水(94∶6，V/V)，流速1.0mL/min，激发波长365nm，发射波长406nm，柱温30℃。方法的检出限0.1μg/kg，线性范围0.1～50μg/kg，加标回收率92.0%～106.0%，相对标准偏差为1.86%(n＝6)。该法具有样品预处理简单、灵敏度高、精密度高等优点，可用于动植物油脂样品中苯并(a)芘的快速准确测定。

苯并(a)芘；GPC净化系统；高效液相色谱；荧光检测；动植物油脂

苯并(a)芘，即3,4-苯并芘，是一种高活性致癌剂。苯并(a)芘可通过呼吸、食道、皮肤吸收等途径进入人体，主要可诱发皮肤、肺、消化道和膀胱癌[1]，同时可损害中枢神经、破坏淋巴细胞、影响肝脏功能和DNA修复能力等，具有致畸、致突变作用。苯并(a)芘对人体的内分泌系统也有一定的干扰作用，对人类的生存和繁衍构成严重的威胁[2]。

苯并(a)芘广泛存在于自然环境中，食品中也不例外，如烟熏食品、烧烤肉食品、油炸食品、动植物油脂等，被认为是由煤炭、石油、天然气、木材等不完全燃烧产生的[3]。文献中关于水质[4]、空气[5-7]、油炸食品[8]以及肉制品[9-10]中的苯并(a)芘检测方法报道很多，动植物油脂中苯并(a)芘的检测也一直处于探索阶段。现行标准GB/T 5009.27—2003《食品中苯并(a)芘的测定》[11]、GB/T 22509—2008《动植物油脂苯并(a)芘的测定：反相高效液相色谱法》[12]前处理步骤繁多，耗时费力，条件苛刻；陶顺兴等[13]、蔡玉枝等[14]采用甲酸除去样品中的色素等杂质，再用甲酸咖啡因萃取经净化的样品中的苯并(a)芘，同样存在着前处理复杂等问题。吴海智等[15]采用直接将油脂稀释定容的方法进行前处理，虽然简便，但干扰杂质多，检出限高，对色谱柱污染也很严重。本方法采用GPC凝胶净化系统除去干扰物质，建立凝胶渗透色谱-高效液相色谱-荧光检测(gel permeation chromatography-high performance liquid chromatograghy-fluorescence detector，GPC-HPLC-FLD)简便、准确的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

动植物油脂 市售。

苯并(a)芘标准品(含量99.5%) 德国Dr.Ehrenstorfer公司；环己烷、乙酸乙酯和四氢呋喃(均为分析纯) 天津永大化学试剂有限公司；乙腈、甲醇(均为色谱纯)美国Fisher公司；水为艾科浦超纯水机制备的超纯水。

1.2 仪器与设备

GPC净化系统配紫外检测器、AccuPrep MPSTM GPC快速净化柱 美国J2 Scientific公司；1100型液相色谱仪(配荧光检测器) 美国安捷伦公司；R系列旋转蒸发仪 上海申生科技有限公司；N-EVAPTM 116氮吹仪美国Organomation公司；艾科浦超纯水机 重庆颐洋企业发展有限公司。

1.3 标准溶液的配制

准确称取苯并(a)芘标准品适量，用甲醇溶解，配制成质量浓度为100μg/kg的标准储备液。再分别准确量取标准储备液适量，稀释成0.1、1.0、5.0、10.0、25.0、50.0ng/mL系列标准使用液。

1.4 样品处理

称取约1.0g(精确到0.1mg)样品，用环己烷-乙酸乙酯(1∶1)溶解并定容于10.0mL，将稀释液转移至GPC配备的样品瓶中，上样于GPC净化系统。以环己烷-乙酸乙酯(1∶1)为流动相，流速4.7mL/min净化，收集16～22min的洗脱液，将所得的洗脱液在氮吹仪上(40℃)吹干或旋转蒸发仪上减压蒸干，用乙腈-四氢呋喃(90∶10)溶液溶解并定容于0.5mL，用0.45μm有机滤膜过滤后待测。

1.5 高效液相色谱条件

色谱柱：Hypersil ODS2(150mm×4.6mm，5μm)，流动相：甲醇-水(94∶6，V/V)，流速：1.0mL/min，柱温：30℃；激发波长：365nm；发射波长：406nm，进样量10μL。

1.6 苯并(a)芘的定性定量方法

采用标准物质的保留时间对样品峰进行准确定性，采用外标法以峰面积计算定量，将不同质量浓度的苯并(a)芘标准溶液进样分析，以质量浓度/(μg/L)为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

1.7 加标回收率及精密度实验

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将苯并(a)芘标准溶液加入空白样品中，配制成苯并(a)芘质量加标量为5.0μg/kg的测试样品，用两种国标方法和本论文所建立的方法分别测定苯并(a)芘含量，测试6次，计算回收率和相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)。并对6种动植物油脂样品及苯并(a)芘加标量为10.0、20.0μg/kg的样品进行分析测试，计算检出限、精密度、回收率。

2 结果与分析

2.1 GPC净化系统的使用

本实验采用GPC净化系统处理样品。为确定苯并(a)芘的洗脱时间，取大浓度的苯并(a)芘溶液上样，在波长254nm处检测，GPC净化系统条件设置同1.4节，得到谱图如图1所示。样品中的苯并(a)芘在16～22min内被洗脱完全，故样品处理可依此时间段收集洗脱液。用样品进行实验，得到谱图如图2所示，可知甘油三酯等较大分子均在16min前得到完全洗脱，16～22min收集的洗脱液中不含或含较少量甘油三酯等较大分子。该方法实现了样品前处理的自动化，减少了前处理步骤，最大限度的降低了待测组分的损失。同时，可去除杂质干扰物，避免了油脂分子进入液相色谱柱干扰测试，保护了色谱柱，延长其使用寿命，并提高的仪器的灵敏度。

图1 苯并(a)芘标准物质的GPC色谱图Fig.1 Gel permeation chromatogram of standard benzo (a) pyrene

图2 样品的GPC色谱图Fig.2 Gel permeation chromatogram of sample

2.2 色谱条件的优化

色谱条件对检测起着至关重要的作用，因此对色谱条件进行优化。比较几种流动相配比条件下的色谱峰，最后发现当甲醇∶水＝94∶6时，保留时间、容量因子适当，基线噪声最低，同时苯并(a)芘和样品中干扰物能达到较好的基线分离。对苯并(a)芘标准溶液分别用激发波长365、375、384nm，发射波长406、410、415nm进行测定，发现激发波长384nm、发射波长406nm时，苯并(a)芘标准溶液的响应值最大。标准溶液及阳性样品的液相色谱图如图3所示。

图3 苯并(a)芘标准溶液(A)及阳性样品(B)的液相色谱图Fig.3 HPLC chromatograms of benzo (a) pyrene standard and positive sample

2.3 高效液相色谱柱的选择

本实验考察数家不同厂家、不同牌号的色谱柱，包括Hypersil ODS2、ZORBAX Eclipse XDB C18、symmetry C18、LiChrosob RP-18、LUNA C18、Inertsil ODS-3、ZORBAX Eclipse PAH。发现每种色谱柱均能满足用本方法处理后的样品测试，并不需要诸如ZORBAX Eclipse PAH等多环芳烃专用分析柱。因此本实验选用价格相对低廉的Hypersil ODS2色谱柱。

将不同浓度的加标样品进行处理并测试，以质量浓度/(μg/L)为横坐标(X)、峰面积为纵坐标(Y)，测定结果经线性回归，线性方程为Y＝1.83×107X＋1025，线性范围为0.1～50ng/mL；线性相关系数为0.9991。以3倍噪声值与最小浓度的色谱峰峰高比较，计算出检出限为0.1ng/mL，按测定方法计算，本方法最低检出限为0.1μg/kg，线性范围0.1～50μg/kg。对抽取的样品进行处理分析，并做了不同浓度的加标实验，表1为6种样品以及10、20μg/kg加标量的分析结果，从表1可以看出，样品的加标回收率处于92.0%～106.0%之间。

表1 6种样品的测试结果及加标回收率Table 1 Results of six samples and recovery

3 讨 论

3.1 本方法与国家标准方法的对比

现行国家标准中可用于动植物油脂中苯并(a)芘检测的方法有GB/T 5009.27—2003、GB/T 22509—2008。本实验与这两种国标方法相比均根据苯并(a)芘的荧光特性，采用成熟的荧光分光光度计或高效液色谱仪-荧光检测器进行检测，但在样品前处理过程中三者区别很大。众所周知，现代仪器分析中耗费时间和精力最多、对结果准确性影响最大的因素即为样品前处理。现对3种方法的前处理过程对比如下：

GB/T 5009.27—2003采用荧光分光光度计测试，由于未通过色谱柱将苯并(a)芘与油脂中甘油三酯等干扰物分离，必须通过液-液萃取、氧化铝层析柱净化、纸色谱分离等复杂的前处理步骤将苯并(a)芘从油脂中提取出来。该操作过程繁杂，实验周期长，劳动强度大，同时由于无法保证不同批次间氧化铝和纸色谱用滤纸条的活度、特性一致，此方法的最小检出量高，精密度较差、回收率也较低。

GB/T 22509—2008采用Brockmann活度Ⅳ级的中性氧化铝层析柱对样品进行净化处理。利用中性氧化铝中铝原子与苯并(a)芘等芳香烃类富电子化合物的作用力，使之保留在层析柱上。然而中性氧化铝作为正相色谱中具有强极性保留的填料，同样对动植物油脂中主要组份甘油三酯等分子结构上具有极性酯基的油脂分子有保留作用。由于样品甘油三酯含量远远大于苯并(a)芘含量，两者含量之差可达十亿倍以上，这就很难保证在不损失或少损失苯并(a)芘的前提下，过柱后的样品处理液中油脂分子能够减少到不影响极微量苯并(a)芘测定的含量水平。虽然可以通过调节中性氧化铝中含水量来严格控制其Brockmann活度，达到保证油脂分子与苯并(a)芘的最大分离度，但这种平衡关系对氧化铝中含水量的微小变化非常敏感。样品、洗脱液中微量的水分不可避免的被极易吸水的氧化铝吸附后必将破坏最初建立的实验条件与效果。同样会导致检出限、精密度、回收率无法得出满意的结果。

本方法通过GPC净化系统处理样品，可去除样品中的油脂分子、色素等杂质的干扰。GPC净化系统原理为体积排阻色谱，可根据样品分子中各组分分子质量的不同将其分离，分子质量大的组分先流出，分子质量越小的组分越容易被凝胶颗粒中的孔洞所阻滞，流出越慢。油脂的皂化值一般在180～200mg/g之间，由此可算出其主要成分甘油三酯的平均相对分子质量在800～1000之间。油脂中甘油三酯平均相对分子质量与相对分子质量仅为252的苯并(a)芘相比，差异很大，这使得两者在GPC净化系统中能够得到很好的分离，达到去油效果。同时体积排阻色谱的分离机理只与分子质量相关，样品组分和固定相之间保留机理简单，两者之间原则上不存在相互作用力，使得凝胶净化柱清洗过程简单，使用寿命长，即使大量、多次上样也很容易恢复到初始柱效。而采用商品化成品柱，性能稳定，质量有充分保证。基于以上优点，本方法实验过程中不需过多考虑净化柱的次级保留效应，以及样品中强保留的杂质分子滞留在柱上引起净化柱保留特性的改变等因素，使得整个净化过程发始终在可控条件下运行，避免了国标方法需时刻关注不同批次试剂质量，二氧化铝活性变化，样品污染净化柱，待测组分与杂质分离不完全等因素引起的工作量加大，苯并(a)芘损失，精密度下降，方法无法重现的现象。

将一空白样品加标配制成苯并(a)芘为5.0μg/kg的测试样，用3种方法分别测试6次，检出限、精密度、回收率见表2。表明本实验建立的方法在这些参数方面均优于两种国家标准，测试结果更为准确可靠。3.2 注意事项

表2 苯并(a)芘3种检测方法的参数比较Table 2 Parameter comparison of three detective methods of benzo (a) pyrene

该检测方法使用荧光检测器，荧光检测器灵敏度高，对于极微量的苯并(a)芘既有较高的响应值。然而，苯并(a)芘广泛存在于自然界中，特别是有机试剂在生产、运输、储存过程中极易产生苯并(a)芘，因此对于灵敏度极高的本方法，很容易产生假阳性。所以本方法对试剂提出了严格的要求，GPC净化系统的洗脱液最好使用高纯的环己烷和乙酸乙酯；若使用分析纯试剂，必须进行空白实验，并在结果计算时给予扣除。另外，液相色谱流动相中溶解的少量氧气易产生荧光猝灭效应，即使带有在线脱气机的仪器，流动相在使用前也要脱气处理。

4 结 论

本实验建立了动植物油脂中苯并(a)芘残留量的测定方法，该方法样品前处理简单，去除杂质效果好，灵敏度高，精密度、方法复现好等优点，是测定动植物油脂中苯并(a)芘含量的理想方法。

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Determination of Benzo(a) pyrene in Animal Fats and Vegetable Oils by Gel Permeation- High Performance Liquid Chromatography with Fluorescence Detector

MA Jun-gang，ZHANG Huang-tao，YU Hong，REN Shui-ying*
(National Quality Supervision Test Center of Agricultural Byproducts (Xinjiang), U..ru..mqi 830004, China)

This paper describes a method to determine benzo(a) pyrene in animal fats and vegetable and oils using gel permeationhigh performance liquid chromatography with fluorescence detector (HPLC-FLD). In this method, gel permeation cleanup system was used to remove the interference such as triglyceride. Chromatographic separation was achieved by a reverse-phase column of Hypersil ODS2 with the mobile phase consisting of methanol-water (94∶6,V/V) at a flow rate of 1.0 mL/min. FLD were set at 365 nm excitation and 406 nm emission wavelengths, and the column temperature was kept at 30 ℃. The limit of detection was 0.1μg/kg, the calibration curve was linear between a concentration range of 0.1－50μg/kg, the recoveries were in the range of 92.0%－106.0%, and RSD (n＝ 6) value was 1.86%. The method is simple, rapid, accurate and sensitive for directly determining benzo(a)pyrene in animal fats and vegetable oils without complicated and time-consuming separation process.

benzo(a)pyrene；GPC cleanup system；high performance liquid chromatography (HPLC)；fluorescence detection (FLD)；animal fats and vegetable oils

TS207.3

A

1002-6630(2012)10-0278-04

2011-04-30

马君刚(1974—)，男，高级工程师，硕士，主要从事食品检验研究。E-mail：mjg205270@sina.com

*通信作者：任水英(1981—)，女，工程师，硕士，主要从事食品检验研究。E-mail：renshuiying@yahoo.com