响应面法优化红小豆豆渣中蛋白的提取工艺

张 波，黄 英，薛文通

（中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京100083）

响应面法优化红小豆豆渣中蛋白的提取工艺

张 波，黄 英，薛文通*

（中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京100083）

采用碱溶酸沉的方法对红小豆豆渣中的蛋白进行提取。通过单因素实验考察了pH、提取温度、提取时间、料液比对蛋白提取率的影响，并通过响应面实验对蛋白的提取条件进行了优化。结果表明：在最佳提取条件下，即pH10.0、提取温度60℃、提取时间100min、料液比1∶18进行提取，提取率可达62.99%，蛋白质的纯度为93.25%。

红小豆豆渣，蛋白提取，响应面

红小豆是一种高蛋白、低脂肪、多营养的功能食品[1]。目前，我国红小豆主要利用其中的淀粉加工生产豆沙、豆馅，在生产过程中会产生大量的红小豆豆渣，这些豆渣中含有丰富的蛋白质，但却很少被利用，大部分用作动物饲料或被废弃。豆类分离蛋白不仅营养价值高，易于吸收，而且大都具有良好的功能性质，可以添加到各种食品中[2-4]。常见的豆类分离蛋白的提取方法有碱溶酸沉法、水酶法、超滤膜法等[5-8]，但目前应用于实际生产中的主要为碱溶酸沉法。本实验采用碱溶酸沉法，利用响应面优化红小豆豆渣中蛋白质的提取条件，为红小豆豆渣的综合利用开发提供一定的参考依据，同时也为红小豆分离蛋白的后续研究提供支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

红小豆豆渣 取自河北文安粮油食品厂，60℃烘干，粉碎，过60目筛，正己烷脱脂；氢氧化钠、浓硫酸、盐酸、乙醇、正己烷、乙酸铅、绷酸等试剂 均为国产分析纯。

GL-20G-II高速冷冻离心机 上海安亭科学仪器厂；pH S-3C精密pH计 上海精密科学仪器有限公司；恒温磁力搅拌器 金坛市美特仪器制造有限公司；电子天平 梅特勒-托利多仪器有限公司；电热鼓风干燥箱 重庆银河实验仪器有限公司；LGJ-10冷冻干燥机 北京四环科学仪器厂；KDY-9820凯氏定氮仪 北京市通润源机电技术有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 红小豆豆渣组分测定 蛋白含量测定：GB/T 5009.5—2003，凯氏定氮法；纤维素含量的测定：GB/T 5009.10—2003，重量法；淀粉含量的测定：GB/T 5009.5—2008，酸水解法；水分含量测定：GB/T 5009.3—2003，105℃恒重法；灰分含量测定：GB/T5009.4—2003，灼烧恒重法。

1.2.2 红小豆蛋白的提取方法 参考Kaur[9]的方法，准确称取红小豆豆渣5.00g，加入适量去离子水，用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH，恒温磁力搅拌器搅拌提取一定时间后，过滤，用1mol/L的盐酸溶液调节到等电点pH5.0[10]，8000×g离心20min，水洗2次，冻干得红小豆分离蛋白，并称重。

红小豆蛋白提取率=分离蛋白中蛋白质量/豆渣中总蛋白质量×100%

1.2.3 红小豆蛋白提取的单因素实验 选定碱液pH、提取温度、提取时间、料液比4个因素做单因素实验，考察各单因素对蛋白提取率的影响。

1.2.4 红小豆蛋白提取的响应面优化实验[11-13]在单因素实验的基础上，采用Design-Expert8.0.5中的Box-Behnken中心组合实验设计响应面实验，优化提取条件，每个组合重复实验三次。

2 结果与分析

2.1 红小豆豆渣中的主要成分

表1 红小豆豆渣的主要成分Table 1 Major components of adzuki bean residues

2.2 蛋白提取率的单因素实验

2.2.1 碱液pH对蛋白提取率的影响 提取温度50℃，提取时间60min，料液比1∶20，pH分别取8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5，考察碱液pH对红小豆豆渣中蛋白提取率的影响，结果如图1。

图1 碱液pH对蛋白提取率的影响Fig.1 Effect of alkali extraction pH on protein yield

图2 提取温度对蛋白提取率的影响Fig.2 Effect of extraction temperature on protein yield

由图1可知，蛋白提取率随着碱液pH的增加呈增加的趋势，pH到达9.0后，提取率保持平稳并略有下降。红小豆中的蛋白质主要为球蛋白，易溶于稀碱、稀盐[14]，过高的pH会使蛋白质中的氨基酸发生反应，影响蛋白质的营养及安全性，综合考虑，选取9.0、9.5、10.0做响应面优化实验。

2.2.2 提取温度对蛋白提取率的影响 碱液pH9.0，提取时间60min，料液比1∶20，提取温度分别取25、35、45、55、65、75℃，考察温度对蛋白提取率的影响，结果如图2。

从图2可以看出，温度对蛋白提取率的影响较大，随着温度的升高，蛋白提取率显著上升，75℃时蛋白的提取率大约是25℃时的2倍。这可能是因为红小豆蛋白的热聚集温度较高，在有限的范围内升高温度，增加了红小豆蛋白的溶解性，并没有导致其热聚集[15]。实验选取50、55、60℃做响应面实验。

2.2.3 提取时间对蛋白提取率的影响 碱液pH9.0，温度60℃，料液比1∶20，分别取提取时间30、60、90、120、150、180min，考察提取时间对蛋白提取率的影响，结果如图3。

图3 提取时间对蛋白提取率的影响Fig.3 Effect of extraction time on protein yield

由图3可知，随着提取时间的延长，蛋白的提取率显著升高，提取时间90min时，提取率为51.77%，之后提取率增加较为缓慢。根据提取时间的单因素实验，选取80、90、100min做响应面优化实验。

2.2.4 料液比对蛋白提取率的影响 碱液pH 9.0，提取温度60℃，提取时间90min，料液比分别取1∶8、1∶12、1∶16、1∶20、1∶24、1∶30，考察料液比对蛋白提取率的影响，结果如图4。

图4 料液比对蛋白提取率的影响Fig.4 Effect of material/liquid ratio on protein yield

从图4中可以看出，蛋白提取率随料液比的增加而增加，在料液比1∶16时提取率最高，豆渣中的蛋白质得到了充分的溶解；继续增加料液比后，提取率反而略有下降，可能因为料液比较高时，在等电点沉淀和离心干燥的过程中损失的蛋白较多。综合考虑能耗，选取1∶14、1∶16、1∶18做响应面优化实验。

2.3 提取条件的响应面优化实验

在单因素实验的基础上，选取碱液pH（X1）、提取温度（X2）、提取时间（X3）、料液比（X4）4个因素，做响应面实验，实验因素及水平见表2，实验设计与结果见表3。

利用Design-Expert8.0.5软件对表3的结果进行回归分析，得二次多项回归方程为：Y=464.09167-70.91367X1+1.49853X2-1.96710X3-8.63017X4-0.83900X1X2+0.051500X1X3-0.78250X1X4+0.023400X2X3+ 0.14100X2X4+0.022750X3X4+6.66800X12+0.027180X22+ 0.00017X32+0.19925X42

表2 中心组合实验因素水平编码表Table 2 Factors and levels in the response surface design

表3 中心组合实验设计与结果表Table 3 Response surface design arrangement and experimental results

对回归模型进行方差分析，结果见表4。由方差分析可以看出，模型P值远小于0.01，模型方程极显著，模型的失拟项不显著，模型选择适合。变异系数反映模型的置信度，变异系数越低，模型的置信度越好；本实验的变异系数是1.87%，说明模型方程能很好地反映真实的实验值。因此，可以用该模型方程来分析和预测不同提取条件下红小豆蛋白的提取情况。

由表4中的P值可知，各因素对提取率的影响大小依次为提取温度>提取时间>碱液pH>料液比。

从图5可以看出，提取温度、时间变化时，响应值变化较大，表现为曲线较陡。提取温度，提取时间对提取率的影响较显著。a-f图还反映出碱液pH与提取温度的交互作用，提取温度与提取时间的交互作用，提取温度与料液比的交互作用对蛋白提取率的影响显著。

表4 模型的ANOVA分析结果Table 4 Variance analysis（ANOVA）for the fitted quadratic regression model

图5 双因素交互作用对蛋白质提取率影响的响应面图Fig.5 Response surface plots demonstrating the pair wise interactive effects of four extraction conditions on protein yield

2.3 最优条件的确定及验证

利用Design-Expert软件对模型进行进一步分析，以获得最优的提取条件。经分析得，在X1=10.0、X2= 60℃、X3=100min、X4=1∶17.89（g/mL），即碱液pH10.0、浸提时间100min、温度60℃、料液比1∶17.89（g/mL）时，得到的理论最大值是64.59%。为了考虑验证实验的可行性，将X4修正为1∶18，采用得到的最佳提取条件进行提取实验，得到的蛋白提取率平均为62.27%，与理论值相差较小。因此响应面法对红小豆豆渣中蛋白提取条件的优化是可行的，模型方程适合。

3 结论

在单因素实验基础上，运用响应面分析法对红小豆豆渣中蛋白的提取条件进行优化。响应面分析得出对蛋白提取率影响大小的因素依次为提取温度、提取时间、碱液pH、料液比；得到的最佳提取条件为碱液pH10.0、浸提时间100min、温度60℃、料液比1∶18，在此条件下的提取率为62.27%，蛋白的纯度为93.25%，方法经验证，稳定可行。

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Optimization of protein extraction from adzuki bean residues by response surface methodology

ZHANG Bo，HUANG Ying，XUE Wen-tong*
（College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China）

Alkali extraction and acid precipitation method was used to extract protein from adzuki bean residues. In the single factor analysis，the effects of alkali extraction pH，extraction temperature，extraction time and material/liquid ratio on the protein yield were measured.The response surface methodology was used to optimize the conditions of extraction.The results showed that the optimum conditions were pH10.0，extraction temperature 60℃，extraction time 100min and material/liquid ratio 1∶18.The yield and purity of adzuki bean protein were 62.99%and 93.25%respectively under the optimized extraction conditions.

adzuki bean residues；protein extraction；response surface methodology

TS210.9

B

1002-0306（2012）07-0247-04

2011－05－30 *通讯联系人

张波（1987-），男，硕士研究生，研究方向：粮食、油脂及植物蛋白工程。

食用豆现代农业产业技术体系资助项目（nycytx-18-G15-01）。