妊娠中期因子在牙周炎治疗前后的表达情况

王 丽，焦晓辉，李晓红

(哈尔滨医科大学附属第一医院，黑龙江哈尔滨 150001)

妊娠中期因子(midkine，MK)是Muramatsa等(1988)［1］在视黄酸诱导的小鼠胚胎肿瘤细胞系HM-1细胞cDNA文库中发现的，属于胚胎发育涉及时空调控分子，作为一种肝素结合生长因子，具有促进神经元生长，加强纤溶酶原激活剂活性，参与创伤修复等作用。近年的研究发现:MK作为一种生长因子，其功能首先被定位于神经系统神经细胞的发育和分化，以后又发现在消化、循环、呼吸、血液、骨骼、泌尿、生殖等诸多系统中都有MK的存在，MK不仅与正常的生理功能有关，还与炎症、创伤、修复及肿瘤等病理生理有关，并有着重要作用，目前作为一种多功能生长因子已被广泛认同［2］。牙周炎是一种慢性细菌感染性疾病，随着对牙周病发病机制的进一步了解，已经清楚地认识到牙周病是多因素疾病，牙周微生物与宿主的相互作用，导致牙周局部有害和有利作用的不同平衡，决定了牙周病的类型、程度和转归的不同。本研究采用免疫组织化学、Western免疫印迹方法检测MK在牙周炎治疗前后的表达情况。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器

兔抗人Midkine抗体、即用型免疫组化S-P试剂盒(北京中山生物技术有限公司);兔抗β-Actin多克隆抗体、抗兔IgG(博士德生物工程有限公司);LEICA SM 2000R产石蜡切片机(德国);YT-6C生物组织摊烤机(湖北);HH-W21-600型电热恒温水浴箱(上海);Olympus-BX-51显微镜(日本)。

1.2 方法

1.2.1 牙周炎动物模型的建立

取体质量100～150 g 7周龄雄性Wistar大鼠(哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供)50只，均牙列完整，牙周牙体无损伤、无发育异常和炎症。按随机设计原则，分为正常对照组(10只)、炎症组和恢复组(每组20只)。炎症组和恢复组大鼠用正畸结扎丝于全牙列牙颈部龈缘水平进行结扎，并饲以Keyes 2000(果糖56%、脱质奶粉28%、面粉6%、酵母4%、苜宿粉3%、动物肝粉1%、食盐2%及少量蔬菜)。6周后，处死炎症组大鼠并制取标本(牙龈上皮和部分结缔组织);恢复组大鼠除去结扎丝进行牙周基础治疗，术后6周处死并制取标本(牙龈上皮和部分结缔组织)。所有标本均保存于液氮中。

1.2.2 免疫组织化学染色检测

取正常对照组、炎症组和恢复组大鼠牙周组织标本，经40 g/L中性多聚甲醛固定后，石蜡包埋，3 μm厚连续切片用 APES处理的载玻片捞片，37℃烘烤，分别进行HE染色、MK免疫组织化学染色。(操作步骤按试剂盒说明书进行)，光学显微镜下观察，以细胞质中出现清晰棕黄色颗粒的细胞为阳性细胞。结果以阳性细胞数所占比例表示:光镜(×400)下随机选取10个视野，每个视野计数100个细胞，阳性细胞数≤5%者为阴性(-)，6% ～15%者为弱阳性(+)，16% ～50%者为中强阳性(++)，＞50%者为强阳性(+++)。

1.2.3 Western-blotting 检测

分别取炎症组、恢复组大鼠牙周组织(牙龈上皮全层和部分结缔组织)50 mg，进行裂解、匀浆，取上清液 8 μL 变性 10 min，点样，以 150 g/L、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，将分离的蛋白转移至尼龙膜，用50 g/L脱脂奶粉封闭过夜。用1∶500兔抗人MK抗体室温孵育1.5 h，TBS-T充分洗涤，将该膜置于1∶1000鼠抗兔IgG室温孵育1.5 h，TBS-T充分洗涤，暗室中使用ECL试剂盒显影、定影、洗片。采用BANDLEADER分析软件扫描，分析各条带的光密度值，作为目的蛋白的表达量。

1.3 统计学分析

采用SPSS 13.0软件进行统计分析，计数资料用卡方检验;计量资料以均数±标准差()表示，两组间比较用t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 免疫组织化学染色

MK阳性表达于龈上皮、沟内上皮和结合上皮细胞胞浆中，呈棕黄色颗粒，偶见胞核中亦有表达(图1～3)。炎症组中MK的表达主要集中于棘细胞层和颗粒细胞层(图2)。恢复组中MK的表达主要集中于棘细胞层和基底细胞层(图3)。正常对照组中MK的表达较少(图1)。阳性细胞计数显示:炎症组以弱阳性为主，恢复组以强阳性和中强阳性为主;正常对照组大部分为阴性，仅2例为弱阳性。经 χ2检验，3组间差异有统计学意义(P ＜0.05)(表1)。

表1 各组MK表达程度比较

图1 MK在正常对照组牙龈组织中表达的免疫组化染色(×40)

图2 MK在炎症组牙龈组织中表达的免疫组化染色(×40)

图3 MK在恢复组牙龈组织中表达的免疫组化染色(×40)

2.2 Western-blotting免疫检测

用Western-blotting方法对标本进行MK蛋白表达的检测，可见在分子量为15 kDa处有蛋白条带出现(图4)。

图4 恢复组和炎症组MK蛋白电泳结果

BANDLEADER软件扫描分析各条带的光密度值(表2)显示:恢复组MK表达量明显高于炎症组，差异有统计学意义(P＜0.05)。

表2 炎症组与恢复组MK表达量比较 (A值)

3 讨论

MK作为近年来发现的一个新的肝素结合生长因子可以诱导人皮肤纤维母细胞分泌胶原蛋白，是一种有效的胶原和粘多糖分泌刺激剂，对刺激伤口愈合有重要作用。有研究发现:当皮肤烧伤后，MK阳性细胞开始浸润皮下结缔组织，烧伤后2 d此区域中MK阳性细胞数量达到高峰，之后迅速减少，蛋白印迹法显示这些MK为30 kDa的二聚体［3］。MK在正常完整的胃肠道，特别是黏膜下层和肌层中有表达，主要位于细胞的基底膜中。有学者观察急性和慢性胃黏膜损伤的大鼠模型时发现:在慢性纤维母细胞反应修复胃溃疡过程中，MKm-RNA表达持续增高，而且慢性纤维母细胞系MRC-5MK表达强烈，提示在深层溃疡修复过程中MK对成纤维细胞增生有促进作用;在心肌梗塞的早期也有MK的表达，表明MK对心肌的修复有促进作用［4］。

MK与炎症反应密切相关，可以通过诱导肥大细胞释放组织胺引起炎症反应，同时还可通过触发细胞内钙离子的活性诱发人中性粒细胞趋化作用。MK在类风湿、骨关节炎等疾病中通过中性粒细胞也起作用［5］。有研究发现MK在实验性视觉损伤的模型中，能够减少损伤。即利用强光持续照射，造成实验性视觉损伤，同时在玻璃体内注射MK，1周后发现:注射MK的视网膜外核层厚度和视觉电位与对照组差异显著，并且能使损伤的视神经得到修复［6］。

牙周炎是一种慢性感染性疾病，微生物与宿主的相互作用决定了疾病的过程和进展。微生物可以通过自身代谢产物引起组织破坏，直接发挥致病作用，或通过刺激和改变宿主反应间接起致病作用。随着对牙周病发病机制的进一步了解，现已经清楚地认识到牙周病的大多数组织损害是由于宿主对感染的应答引起的。MK不仅与生理功能有关，还与炎症、创伤、修复等有关，但其在口腔牙周炎中的表达研究尚未见到相关报道。

本研究首先采用免疫组化方法对MK进行了定性研究，明确MK主要定位于龈上皮、沟内上皮和结合上皮细胞的胞浆中，其主要定位于牙龈上皮组织而非结缔组织中。同时定量分析发现:恢复组组织中MK表达阳性率明显高于炎症组。炎症组中MK的表达主要为弱阳性、中强阳性;恢复组中MK的表达多呈强阳性或中强阳性，提示:MK在牙周炎发生发展的过程中既有致炎作用，又有促进组织恢复的作用，在炎症进行过程中主要参与致炎，而在治疗后其促进组织恢复的作用更明显，也就是MK在炎症组织恢复愈合中发挥的功能更显著。

Western-blotting印迹法主要应用于某些特定蛋白质的鉴别和定量，由于其具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，可以检测出1～5 ng中等大小级别的待测蛋白。本研究运用Western-blotting方法对炎症组和恢复组牙龈组织中的MK进行了定量分析，比较二者MK蛋白的表达量，发现在治疗后恢复组中MK的表达量明显高于治疗前炎症组，进一步说明其具有显著促进组织恢复作用，与免疫组化研究结果基本一致。

本结果可见两种方法检测蛋白水平的表达结果是一致的，Western-Blotting免疫印迹具有直观性，免疫组织化学检验更为微观的表达，而且将表达准确定位。所得结果初步为牙周炎症性疾病发病因素的研究、临床诊断、预后观察等临床和基础工作提供了有一定参考价值的信息，但MK在组织中具体致炎和促进组织恢复的作用机制还有待于更深入的研究。

［1］Sumi Y，Muramatsu H，Hata K，et al.Midkine enhances early stages of collagen gel contraction［J］.J Biochem(Tokyo)，2000，127(2):247-251.

［2］Kato K，Kosugi T，Sato W，et al.Growth factor Midkine is involved in the pathogenesis of renal injury induced by protein overload containing endotoxin［J］.Clin Exp Nephrol，2011，15(3):346-354.

［3］Svensson SL，Pasupuleti M，Walse B，et al.Midkine and pleiotrophin have bactericidal properties:preserved antibacterial activity in a family of heparin-binding growth factors during evolution［J］.J Biol Chem，2010 ，285(21):16105-16115.

［4］Scholl B，Bersinger NA，Kuhn A，et al.Correlation between symptoms of pain and peritoneal fluid inflammatory cytokine concentrations in endometriosis［J］.Gynecol Endocrinol，2009，25(11):701-706.

［5］Ishikawa E，Ooboshi H，Kumai Y，et al.Midkine gene transfer protects against focal brain ischemia and augments neurogenesis［J］.J Neurol Sci，2009，285(1-2):78-84.

［6］Narita H，Chen S，Komori K，et al.Midkine is expressed by infiltrating macrophages in in-stent restenosis in hypercholesterolemic rabbits［J］.J Vasc Surg，2008，47(6):1322-1329.