核磷蛋白小分子抑制剂NSC348884对肝癌细胞HepG2的体外抑制作用

张 洁，赵浩亮，贺杰峰，李辉宇

山西医科大学第一医院普通外科，太原030001

原发性肝癌是世界上最高发的癌症之一，早期诊断率低，术后复发率高，一经发现多为晚期［1-2］，因此寻求新型有效的抗肝癌药物具有重要意义。NSC348884是Qi等［3］于2008年首次报道的一种核磷蛋白 (nucleophosmin，NPM)小分子抑制剂。它能特异性破坏NPM氨基末端的疏水口袋结构，从而抑制NPM寡聚物的形成，破坏其在癌细胞中的异常功能。该研究表明NSC348884可在多种癌细胞系中抑制细胞的增殖，包括前列腺癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌、淋巴癌。因此，NSC348884将可能成为抗癌治疗的新型药物。最新研究表明，NPM在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)中呈高表达，可能是潜在的HCC标志物［4］。NPM将可能成为肝癌治疗的新靶点，而关于NSC348884对肝癌细胞的作用尚少有报道。本研究旨在观察NSC348884对肝癌细胞HepG2体外生长的抑制效应，并探讨其作用机制。

材料和方法

细胞培养HepG2肝癌细胞株 (购自中国科学院)培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基(另加入青霉素50 U/ml和链霉素60 μg/ml)中，温度37℃，含5%的CO2，选用对数生长期的细胞进行实验。

噻唑蓝检测细胞增殖HepG2细胞以5×104/ml的浓度接种于96孔板中，每孔200 μl，设3个复孔。培养24 h后更换NSC348884(美国Sigma公司)终浓度为0、0.01、0.1、1、2、5、10、40、50 μmol/L 的10%胎牛血清培养液。培养4 d后，加入噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)，4 h后，弃培养液，加入二甲基亚砜100 μl，培育5 min，用酶标仪于490 nm波长处测定吸光度。实验组按下列公式计算细胞存活率:存活率 (%)=加药细胞平均吸光度值/对照细胞平均吸光度值×100%，绘制细胞增殖曲线图。

免疫印迹法检测寡聚物及单体的表达变化0 μmol/L(空白对照)、2 μmol/L NSC348884 分别处理肝癌细胞HepG2，24 h后胰酶消化，收集细胞。按核蛋白提取试剂盒方法提取核蛋白。Bradford法进行蛋白质定量。取50 μg蛋白质分别做浓度为15%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)及非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 (native polyacrylamide gel electrophoresis，native PAGE)，电泳完毕将蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜上，小牛血清封闭2 h，兔抗人NPM一抗 (CST公司)1∶1000室温孵育过夜，辣根过氧化物酶标记的二抗 (美国Santa Cruz Biotechnology公司)室温孵育1 h，最后使用二氨基联苯胺试剂显色 (美国DAKO公司)。

流式细胞术检测细胞凋亡率0、1、2 μmol/L的NSC348884处理细胞，培养24 h后收集细胞，冷磷酸盐缓冲液洗涤，重悬于4℃、70%酒精中固定过夜，离心后加入200 μg/ml RNA酶400 μl 37℃处理30 min，再加入 15 μg/ml碘化丙啶 100 μl 4℃避光处理30 min，流式细胞仪 (美国Beckman公司)检测细胞凋亡率。

统计学处理所有实验均重复3次，使用SPSS 13.0统计软件包处理数据，采用两独立样本t检验和单因素方差分析，数据以均数±标准差表示，P＜0.05认为差异有统计学意义。

结 果

NSC348884抑制HepG2细胞增殖活性MTT结果显示，NSC348884在0.01 μmol/L低浓度时吸光度与对照组比较差异无统计学意义 (P＞0.05);浓度为0.1 μmol/L 和 1 μmol/L 时，细胞存活率分别为(72.333±5.774)%和 (74.667±4.163)%、二者比较差异无统计学意义 (P＞0.05);当浓度在1～10 μmol/L之间时，明显抑制了细胞的生长，浓度为2、5、10 μmol/L时存活率分别为(35.333±4.041)%、(17.667±2.082)%、(22.333±2.887)%，与对照组比较差异有统计学意义 (P＜0.05);NSC348884浓度为 40、50 μmol/L时，存活率分别为 (26.333±1.528)%、(28.000±1.732)%、二者比较差异无统计学意义 (P＞0.05)。NSC348884对肝癌细胞HepG2的半数抑制浓度 (50%inhibiting concentration，IC50)为 1.4 μmol/L。

NSC348884破坏HepG2细胞NPM寡聚物结构0 μmol/L 及2 μmol/L NSC348884 处理 HepG2 细胞24 h后，与0 μmol/L组相比，2 μmol/L组的NPM寡聚物表达量明显降低，而单体的表达量增高 (图1)。图像分析结果显示，2 μmol/L组寡聚物蛋白条带灰度比值 (0.289±0.035)明显低于0 μmol/L组寡聚物蛋白条带灰度比值 (1.443±0.041)(P＜0.05);而2 μmol/L组单体蛋白条带灰度比值(1.781±0.101)明显高于0 μmol/L组单体蛋白条带灰度比值 (1.122±0.007)(P＜0.05)。

图1 NSC348884特异性破坏NPM寡聚物结构Fig 1 NSC348884 specifically disrupts NPM oligomer

NSC348884诱导HepG2细胞的凋亡0、1、2 μmol/L NSC348884处理HepG2细胞24 h后，凋亡率分别为 (6.950±0.207)%、(13.770±0.335)%、(19.021±0.237)%。处理组与对照组比较，差异有统计学意义 (P ＜0.05);2 μmol/L与1 μmol/L处理组比较，差异有统计学意义 (P＜0.05)(图2)。

讨 论

HCC一经发现多为晚期，对不宜手术者，化疗是主要的治疗方法。化疗药物的作用机制很多，而蛋白-蛋白相互作用位点是强有力的干预靶点，是发展抗癌药物的热点，目前以蛋白-蛋白相互作用位点为靶点的化疗药物的应用已经成为现实［5］。

NPM是主要的核仁磷酸化蛋白，其结构特征包括一个氨基末端保守的寡聚化区［6-7］，NPM的寡聚化可能是调节NPM多种功能的必要步骤［8］。研究表明，NPM在多种实体肿瘤中存在高表达，被认为是结肠癌、胃癌、卵巢癌和前列腺癌的肿瘤标志物之一［9］。此外，有研究表明Rev蛋白的一个肽与NPM结合使Ras转化的NIH-3T3细胞产生细胞毒性，从而抑制裸鼠模型中肿瘤的生长［10］。这是关于抑制NPM后产生抗肿瘤作用的首次报道。

图2 NSC348884诱导肝癌细胞HepG2凋亡Fig 2 NSC348884 induces the apoptosis of hepatocellular carcinoma cell line HepG2

基于上述研究，Qi等［3］通过对NPM分子模型三维结构的研究，确定影响其寡聚物形成的药效基团，然后经计算机筛选以及相互作用而确定了一种NPM的小分子抑制剂——NSC348884。他们的研究表明NSC348884以1.7～4.0 μmol/L的IC50在多种癌细胞系中抑制了细胞的增殖。Yun等［4］的最新研究证实，NPM在HCC中呈高表达，且显著高于非癌肝组织;NPM在HCC中的高表达与增殖细胞核抗原水平以及血清甲胎蛋白、肝硬化等临床预后参数相关;NPM可能是潜在的HCC标志物。因此，NPM可能是一个潜在的原癌基因，将可能成为肝癌治疗的新靶点。

本研究应用MTT比色法测定NSC348884对HepG2细胞存活率的影响，结果显示NSC348884对肝癌细胞HepG2生长有抑制作用，药物浓度在1～10 μmol/L之间时，对细胞的抑制作用最明显，随药物浓度增加，细胞的存活率降低，呈剂量-效应关系。NSC348884的IC50为1.4 μmol/L。随后通过对不同浓度NSC348884处理组进行Native PAGE、SDSPAGE免疫印迹检测，结果表明NSC348884能特异性破坏肝癌细胞HepG2中NPM寡聚物结构，促使其寡聚物转化为单体，这是NSC348884发挥抗肿瘤作用的分子基础。

研究表明，NSC348884通过上调p53(增加15位丝氨酸的磷酸化)，以剂量依赖方式诱导多种肿瘤细胞的凋亡［3］。本研究用流式细胞术检测细胞凋亡，结果显示NSC348884以剂量依赖方式诱导了肝癌细胞HepG2凋亡的发生，而有关诱导肝癌细胞凋亡的具体机制尚需进一步研究。

综上所述，本研究显示NSC348884通过促使肝癌细胞HepG2中NPM寡聚物转化为单体，从而抑制HepG2细胞的体外增殖，并且可以诱导肝癌细胞凋亡，而其诱导肝癌细胞凋亡的机制尚需进一步研究。

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