框镜鲤维氏气单胞菌CY0806株鞭毛flaA基因的克隆与生物信息学分析

单晓枫，吴同垒，孟庆峰，王伟利，钱爱东

(1 吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春 130118;2 吉林出入境检验检疫局，吉林长春 130062）

维氏气单胞菌(Aeromonas veronii，AV)隶属于弧菌科气单胞菌属，是一种人－兽－鱼共患病原菌.其不仅在人抵抗力下降时，感染机体引发人的坏死性脑炎、败血症、腹泻等疾病［1－3］;而且也可引发水生动物的疾病，给水产养殖业造成巨大损失［4－6］.AV 有多种毒力因子，主要包括外毒素、蛋白酶、鞭毛、外膜蛋白等，其中，鞭毛作为大多数细菌的主要运动器官，在细菌致病性方面，起着举足轻重的作用.目前，国内AV的研究正处于起步阶段，本研究以框镜鲤Cyprinus carpio AV CY0806为研究对象，克隆其鞭毛flaA基因，并对其编码蛋白质进行了生物信息学分析，以期为框镜鲤AV的发病机理、基因工程疫苗等研究奠定基础.

1 材料与方法

1.1 菌株和载体

框镜鲤AV CY0806株分离自患病框镜鲤，为吉林农业大学预防兽医学研究室保存;大肠埃希菌Escherichia coli DH5α为吉林农业大学动物科学技术学院生物技术研究室保存;pMD18－T vector为宝生物工程(大连)有限公司产品.

1.2 主要试剂

Taq DNA聚合酶、dNTP均为宝生物工程(大连)有限公司产品;DNA凝胶回收试剂盒为爱思进生物技术有限公司产品;质粒小量抽提试剂盒为北京索莱宝科技有限公司产品;气单胞菌培养基RS为北京陆桥技术有限责任公司产品;其他试剂均为进口或国产分析纯.

1.3 引物设计与合成

根据GenBank上发表的AV鞭毛flaA基因序列，应用Primer Premer 5.0和Oligo 6.0软件设计1对引物:上游引物 P1:5'－GCGGAATTCATGGGCCTTTATATCA－3'，下游引物 P2:5'－ACGAAGCTTTTAGCCTTGCCAACAGA－3'，预计扩增片段长 915 bp，该引物由宝生物工程(大连)有限公司合成.

1.4 鞭毛flaA基因的PCR扩增

将低温保存的AV CY0806划线接种于RS培养基上，30℃培养24 h，挑取特征菌落接种于普通LB液体培养基中，30℃培养18 h，取1 mL菌液，提取细菌基因组DNA，具体操作参照细菌基因组DNA提取手册.以菌株CY0806基因组DNA为模板，P1、P2为引物，采用50 μL反应体系进行PCR扩增flaA基因，反应条件:94℃预变性5 min，94℃ 1 min、58℃1 min、72℃ 1 min、循环32次，最后72℃延伸10 min，PCR产物于4℃保存.

1.5 鞭毛flaA基因的克隆及鉴定

将PCR扩增产物用0.01 kg/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，用DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段，并与pMD18－T verctor连接，转化至 DH5α 感受态细菌.将转化产物涂布于含氨苄青霉素LB固体培养基上，37℃培养12～16 h，挑取单个菌落、增菌，用小量质粒抽提试剂盒提取质粒并进行PCR验证，筛选出阳性重组质粒送至宝生物工程(大连)有限公司进行序列测定.

1.6 鞭毛flaA基因的序列分析及系统进化树构建

将所测flaA基因序列用Blastn进行比对，并从NCBI上下载气单胞菌属不同菌种的flaA基因，应用Mega4.0软件构建系统进化树.

1.7 鞭毛flaA基因编码蛋白的生物信息学分析

将flaA基因开放阅读框录入DNAStar的Editseq工作区，用Translate DNA功能翻译flaA氨基酸序列;利用 http:∥www.expasy.org/cgi－bin/protparam预测蛋白质基本理化性质;利用 SingalP v 3.0(http:∥www.cbs.dtu.dk/sercices/SingalP)对氨基酸序列信号肽进行分析;利用TMHMM v 2.0(http:∥genome.cbs.dtu.dk/services/TMHMM－2.0)对序列跨膜区分析;利用BioEdit和DNAStar分析序列亲水性和疏水性;利用DNAStar软件的Proteam分析氨基酸序列的二级结构;利用 Swiss－Model Workspace(http:∥swissmodel.expasy.org/wokspace)对蛋白质结构做同源建模.

2 结果与分析

2.1 鞭毛flaA基因的PCR扩增和鉴定

以菌体基因组DNA为模板，经PCR扩增出约915 bp的特异性条带(图1).将扩增的flaA基因片段纯化后与pMD18－T verctor连接，经氨苄青霉素抗性筛选后，阳性重组质粒通过PCR鉴定，得到与目的基因大小一致的片段(图2).

图1 框镜鲤AV CY0806 flaA基因的PCR扩增Fig.1 Amplified flaA gene from Cyprinus carpio AV CY0806 by PCR

图2 重组质粒的PCR鉴定Fig.2 Identification of recombinant plasmid by PCR

2.2 鞭毛flaA基因的序列分析与系统进化树构建

经序列测定，flaA基因全长915 bp，编码304个氨基酸.序列比对与系统进化树分析(图3)结果表明:维氏气单胞菌CY0806株flaA基因与维氏气单胞菌EU410309和EU410323的flaA基因进化距离近.

图3 框镜鲤AV CY0806 flaA基因的系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree of Cyprinus carpio AV CY0806 flaA gene

2.3 鞭毛flaA基因编码蛋白生物信息学分析

2.3.1 鞭毛flaA基因编码蛋白分子特征 鞭毛flaA基因编码蛋白推导相对分子质量32098.66，含有23个强碱性氨基酸(K、R)、24个强酸性氨基酸(D、E)、105 个疏水氨基酸(A、I、L、F、W、V)、121 个极性氨基酸(N、C、Q、S、T、Y)，等电点为 5.57，推测分子式C1853H2229N409O474S9，消化系数7450，半衰期为30 h(体外哺乳动物类网状细胞)、大于20 h(在酵母体内)及10 h(在大肠埃希菌体内)，不稳定系数32.31(稳定蛋白)，脂肪系数81.05.

2.3.2 鞭毛flaA基因编码蛋白的信号肽与跨膜区分析 通过SingalP软件预测分析，鞭毛flaA基因编码蛋白分子无信号肽;TMHMM分析结果显示:此蛋白分子不存在跨膜区.

2.3.3 鞭毛flaA基因编码蛋白的亲水性和疏水性分析 利用BioEdit和DNAStar分析:鞭毛flaA基因编码蛋白最大疏水指数1.86，最小疏水指数－2.68;最大亲水指数2.68，最小亲水指数－1.86.其分析结果如图4所示.

2.3.4 鞭毛flaA基因编码蛋白的二级结构预测

通过Gamier－Robso方法预测蛋白质二级结构发现，鞭毛flaA基因编码蛋白分子存在11处α螺旋、21处β折叠、β转角和无规则卷曲则相对较少;而应用Chou－Fasman方法，发现有10处 α 螺旋、11处 β 折叠、β转角则多至18处.

2.3.5 鞭毛flaA基因编码蛋白的三维结构预测

将推导的氨基酸序列利用Swiss－Model Workspace进行同源建模，以第2～303位氨基酸序列预测鞭毛flaA基因编码蛋白的三维结构(图5).

图4 框镜鲤AV CY0806 flaA蛋白的疏水性和亲水性分析Fig.4 Hydrophilicity prediction and hydrophobicity prediction of Cyprinus carpio AV CY0806 flaA

图5 flaA三维结构预测Fig.5 3D structure prediction of flaA

3 讨论

维氏气单胞菌作为一种较新型的人－兽－鱼共患病原菌，在引发人的各种疾病的同时，近年来，已有相当多的报道，证明其可以感染多种水生动物并引发多种疾病的流行.本研究所用菌株即为框镜鲤败血症病原菌［7］，该菌株经试验证实，可以感染多种鱼类并引起相应的病症，但其发病机理尚不清楚.而鞭毛作为多种细菌的运动器官，在细菌感染、免疫等方面发挥重要作用，其主要化学组成为蛋白质，具有良好的免疫原性.目前，从基因水平研究病原菌的鞭毛，是研究病原菌致病的分子机制和研发基因工程疫苗的基础［8－9］.为此，本试验对框镜鲤源 AV鞭毛flaA基因进行了克隆并对其编码蛋白进行了相关生物信息学的分析.

本研究从框镜鲤AV CY0806株中克隆了flaA基因，经PCR与测序分析，成功地获得了长915 bp的flaA基因，其编码304个氨基酸，与其他气单胞菌属的菌株进行相似性分析，发现菌株CY0806 flaA基因与 GenBank上的维氏气单胞菌 EU410309、EU410323进化距离较近，进化树在同一分支上.但也发现，有部分基因存在差异，可能与菌株来源、地域差异有很大关系.

预测蛋白质的三维立体结构，是了解蛋白质空间结构信息的重要途径，其预测方法以同源建模、线串法和从头建算法为主［10］，其中，同源建模法是最为成功和准确的方法.本研究以同源建模法预测了flaA三维立体结构.预测结果，将有利于对蛋白质结构进行改造，使蛋白质的相应特性更趋于理想;另一方面还可进行分子设计，使可能成为药物的蛋白质更好地与受体结合，充分发挥药物的功效［11］.

本试验克隆了维氏气单胞菌CY0806株的flaA基因，构建了系统进化树，并对其编码的蛋白进行了生物信息学分析，为以后研究维氏气单胞菌的发病机制、诊断方法的建立及研发疫苗以预防由AV引起的疾病提供了理论依据，为更好地研究这一新型人－兽－鱼共患病原菌奠定了基础.

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