莪术醇对人胃癌细胞凋亡、MMP2、NO影响的初步探讨

徐立春 陈海燕 文 洁 陶亚玲

扬州大学医学院肿瘤防治研究中心，江苏扬州 225001

莪术醇对人胃癌细胞凋亡、MMP2、NO影响的初步探讨

徐立春 陈海燕 文 洁 陶亚玲

扬州大学医学院肿瘤防治研究中心，江苏扬州 225001

目的 初步探讨莪术醇（Curcumol）对人胃腺癌细胞（SGC-7901细胞）凋亡、基质金属蛋白酶（MMP2）、一氧化氮（NO）的影响。 方法 将莪术醇溶于无水乙醇中，初始浓度为9 mg/mL，设实验1、2、3、4、5组，莪术醇的浓度分别是7.5、15、30、60、120 μg/mL，并以含 1%无水乙醇的培养液为对照组。 采用台盼蓝（Trypan blue）、噻唑蓝（MTT）法检测SGC-7901细胞的活性及莪术醇对SGC-7901细胞抑制增殖的影响；用流式细胞仪 （FACSCalibur）检测莪术醇对SGC-7901细胞的凋亡率；用蛋白质印迹法检测莪术醇作用于SGC-7901细胞后，其MMP2的表达情况；NO试剂盒检测莪术醇作用SGC-7901细胞后的细胞培养液上清的NO含量。 结果30μg/mL的莪术醇在药物浓度与抑制肿瘤生长方面效果较佳，与对照组比较，其抑制肿瘤细胞增殖差异有统计学意义（P<0.05）；莪术醇实验组能促进细胞凋亡，与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）；莪术醇实验组作用细胞后，其MMP2蛋白表达明显下降，与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）；实验研究表明，随着莪术醇实验组浓度的增加，其细胞培养液上清中的NO含量逐渐降低，与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。 结论 30μg/mL的莪术醇浓度是最佳药效组，它能显著抑制SGC-7901细胞的增殖，明显促进肿瘤的细胞凋亡，显著抑制MMP2的表达，降低细胞培养液上清中的NO含量，从而发挥系列抗肿瘤作用。本研究从细胞分子水平探讨莪术醇治疗胃癌可能存在的部分机制，为临床应用莪术醇及其衍生物或结构类似物治疗胃癌提供理论与试验依据。

莪术醇；SGC-7901；凋亡；基质金属蛋白酶；一氧化氮

胃癌在我国是最常见的恶性肿瘤之一，手术是其最有效的治疗方法，对于术后复发失去再次手术机会的及晚期胃癌患者，化疗仍是最有效的手段之一，但其疗效不尽人意，因为在消灭肿瘤细胞的同时，受其毒副作用影响而表现出较差的预后。因而寻求一种新的治疗方案迫在眉睫。肿瘤的靶向治疗基于分子水平，通过抑制相关蛋白或基因在信号转导通路、血管生成等途径发挥较强的抗肿瘤作用，且细胞毒性作用明显减少，故成为肿瘤治疗的新希望。

近年来，中药及其有效成分抗肿瘤作用的研究取得很大进展。研究显示，天然药物及有效成分可以通过诱导细胞凋亡、细胞分化、抑制血管生成、逆转多药耐药等发挥抗肿瘤作用。同时中药具有多靶点、多环节、多效应、毒副作用低、提高机体免疫力、不易产生耐药等优点。莪术醇（Curcumol）又名姜黄环奥醇，为具有半缩酮的氢化奥类化合物，为莪术的提取物——莪术挥发油中抗肿瘤活性成分。目前研究发现莪术提取物莪术醇能杀伤肿瘤细胞，诱导肿瘤细胞凋亡，有抑制血管生成的作用，且不良反应少，有学者认为抑制肿瘤生长与抑制环氧化酶2mRNA和血管内皮生长因子mRNA的表达有关[1-4]。

本研究以人胃腺癌（SGC-7901）细胞为研究对象，采用现代高新技术从细胞分子水平探讨莪术醇抑制胃癌细胞生长可能存在的部分机制，为临床应用莪术醇及其衍生物或结构类似物治疗胃癌提供理论与实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

①莪术醇 （纯度95%）：扬州大学中西医结合研究所提供。②RPMI-1640培养基：美国GIBCO公司；③Annexin VFITC试剂盒：上海晶美生物工程有限公司；④Braford检测蛋白含量试剂盒、Mouse Anti-actin、山羊抗兔IgG-HRP、山羊抗鼠IgG-HRP：武汉博士德生物工程有限公司；⑤Rabbit Anti-MMP2：美国eBioscience公司；⑥NO试剂盒：南京建成生物公司；⑦MTT、DMSO：上海生工生物工程有限公司；⑧细胞株：人胃腺癌SGC-7901细胞株由上海细胞生物所提供。

1.2 方法

1.2.1 将莪术醇溶于无水乙醇溶液，其工作浓度中乙醇的最终浓度为1%，设实验组和对照组，实验组莪术醇的浓度为7.5、15、30、60、120 μg/mL。SGC-7901 细胞复苏后加入 RPMI1640培养液（pH=7.2，10%小牛血清，青霉素及链霉素各100 U/mL）后置于CO2培养箱中培养，2～3 d传代一次。用对数生长期的细胞进行实验。

1.2.2 采用MTT法检测不同浓度组的莪术醇对人胃腺癌SGC-7901细胞细胞增殖的影响。将对数生长期的SGC-7901细胞计数接种于96孔培养板，每孔约5 000个细胞，设6个复孔，200μL/孔，置于CO2培养箱中培养，24 h后，更换含莪术醇的培养液，药物浓度及分组按实验设计进行。培养48 h后，于每孔加入20μL四甲基偶氮唑蓝（MTT）溶液（5 mg/mL），置于培养箱中继续培养4 h后，终止培养，弃上清，每孔分别加入150μL二甲基亚砜（DMSO），轻轻振荡10min，使结晶充分溶解。酶标仪在波长490 nm下测定各孔的OD值，记录结果。

1.2.3 流式细胞仪（FACSCalibur）检测莪术醇对SGC-7901细胞凋亡率的影响。SGC-7901细胞培养、莪术醇的药物浓度及分组同前。然后将乙醇固定的细胞离心洗涤后去上清，摇匀，调整细胞浓度至1×105个/mL，加入Binding Buffer 500μL悬浮细胞，加入AnnexinV-FITC 5μL混匀后，加入碘化丙锭（Propidium Iodide，PI）5μL，震荡混匀，室温，避光，反应 5～15min，用200目尼龙网滤过后，上机检测，计数10 000个细胞进行细胞凋亡率分析。用流式细胞仪检测，其激发波长Ex=488 nm，发射波长Em=530 nm。此实验重复3次。

1.2.4 用Western Blot法检测莪术醇对SGC-7901细胞基质金属蛋白酶（MMP2）表达的影响。SGC-7901细胞培养、莪术醇的药物浓度及分组同前。实验组、对照组培养48 h，终止培养。然后从SGC-7901细胞中提取总蛋白，用Bradford法检测蛋白含量，接着进行制胶、加样、SDS-PAGE电泳、转膜、免疫印迹操作，所得Western条带应用图像凝胶成像系统存入计算机，用Quantity One灰度分析软件进行光密度计算，以目的蛋白条带灰度值与内参β-actin灰度值的比值作为相应目的蛋白的表达量指标，每个样本重复3次[5]。

1.2.5 用一氧化氮（NO）试剂盒检测莪术醇对SGC-7901细胞培养液中NO含量的影响。SGC-7901细胞培养、莪术醇的药物浓度及分组同前。培养48 h后收集细胞培养液，再1 000 r/min离心5min，收集上清液。用NO试剂盒进行实验，在550 nm波长下测各管吸光度值[6]。

1.3 统计学方法

采用SPSS 10.0统计软件进行处理。计量资料采用均数±标准差（）表示，多组间的比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 莪术醇对SGC-7901细胞生长抑制的影响

7.5 ～120 μg/mL莪术醇处理 SGC-7901肿瘤细胞 48 h后，莪术醇抑制细胞生长作用随其浓度的增加而逐渐增强，实验组的抑制率与对照组比较，差异有统计学意义 （P<0.05）。 见表 1。

表1 莪术醇对SGC-7901细胞生长抑制效应结果比较（，%）

表1 莪术醇对SGC-7901细胞生长抑制效应结果比较（，%）

注：与对照组比较，＊P＜0.05

组别 抑制率对照组（1%无水乙醇组）实验组7.5μg/mL莪术醇组15μg/mL莪术醇组30μg/mL莪术醇组60μg/mL莪术醇组120μg/mL莪术醇组0.19±0.12 4.48±0.35＊8.49±0.49＊30.21±0.71＊45.20±0.79＊57.51±1.30＊

2.2 莪术醇对SGC-7901细胞凋亡的影响

随着莪术醇对SGC-7901肿瘤细胞的浓度增加，SGC-7901细胞发生凋亡的细胞比例逐渐增加，与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

表2 莪术醇对SGC-7901细胞凋亡率的影响效应结果（，%）

表2 莪术醇对SGC-7901细胞凋亡率的影响效应结果（，%）

注：与对照组比较，＊P＜0.05

组别 凋亡率对照组（1%无水乙醇组）实验组7.5μg/mL莪术醇组15μg/mL莪术醇组30μg/mL莪术醇组60μg/mL莪术醇组120μg/mL莪术醇组5.10±0.21 6.62±0.13＊12.25±0.34＊28.80±0.16＊40.75±0.44＊48.84±0.35＊

2.3 莪术醇对SGC-7901细胞MMP2表达的影响

MMP2能降解细胞外基质（ECM）和基底膜成分，使基底膜丧失连续性，从而破坏局部组织结构达到侵袭和转移。不同浓度的莪术醇作用SGC-7901细胞48 h后，提取细胞总蛋白，采用Western Blot检测MMP2蛋白的变化。与对照组比较，不同浓度的莪术醇作用细胞后，随着药物浓度的增加，与对照组比较MMP2蛋白表达均有不同水平的下调，莪术醇实验组与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。见图1。

2.4 莪术醇对SGC-7901细胞培养液中NO含量的影响

随着莪术醇作用浓度的增加，SGC-7901细胞的培养液的上清中的NO含量逐渐下降，除7.5μg/mL莪术醇组外，其他莪术醇组与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。

表3 莪术醇对SGC-7901细胞上清液中的NO含量的影响（，μmol/L）

表3 莪术醇对SGC-7901细胞上清液中的NO含量的影响（，μmol/L）

注：与对照组比较，*P＜0.05

组别 NO含量对照组（1%无水乙醇）实验组7.5μg/mL莪术醇组15μg/mL莪术醇组30μg/mL莪术醇组60μg/mL莪术醇组120μg/mL莪术醇组158.79±7.02 150.06±4.07 137.65±3.55*123.94±2.44*102.95±3.40*78.32±3.88*

3 讨论

随着医学技术的发展，中药及其有效成分抗肿瘤作用的研究取得很大的进展，有研究报道天然药物及其有效成分可以通过诱导细胞凋亡、药物毒性作用、调节细胞信号转导、诱导细胞分化、逆转多药耐药、抑制端粒酶活性等方式发挥抗肿瘤作用。莪术醇是中药莪术中提取的重要成分，目前研究发现，莪术醇作为一种有效的抗肿瘤药物，通过直接杀伤肿瘤细胞、增强肿瘤的免疫原性、增强机体的免疫力、抑制核酸代谢、抑制血管生成、诱导细胞凋亡、影响细胞分化等机制发挥作用[7-9]。

本实验研究表明，莪术醇抑制胃肿瘤细胞生长率分别为：7.5 μg/mL 的莪术醇组生长抑制率是（4.48±0.35）%，15 μg/mL生长抑制率为（8.49±0.49）%，30μg/mL 生长抑制率为（30.21±0.71）%，60 μg/mL 生长抑制率为 （45.20±0.79）%，120 μg/mL生长抑制率为（57.5±1.30）%。从药效比分析30μg/mL莪术醇组是最佳抑制肿瘤细胞增殖的浓度。

细胞凋亡是由死亡信号诱发的受调节的细胞死亡过程，是生理性死亡的普遍形式。凋亡过程中DNA发生片段化，细胞皱缩分解成凋亡小体，被邻近细胞或巨噬细胞吞噬，不发生炎症。与细胞坏死的区别是，坏死是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程，其表现为细胞长大，胞膜破裂，细胞内容物外溢，核变化较慢，DNA降解不充分，引起局部严重的炎症反应。本实验采用流式细胞技术来进行凋亡分析，其原理是在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧，Annexin V与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合，碘化丙啶（PI）不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，能透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V和PI匹配使用，可将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。本实验用流式细胞技术来检测莪术醇对SGC-7901细胞的诱导凋亡作用，结果是：7.5μg/mL的莪术醇组其细胞凋亡率是 （6.62±0.13）%，15μg/mL时其凋亡率为 （12.25±0.34）%，30 μg/mL 时其凋亡率为 （28.80±0.16）%，60 μg/mL 时凋亡率为（40.75±0.44）%，120 μg/mL 凋亡率为（48.84±0.35）%，从这组数据中可以观察到SGC-7901细胞随着莪术醇药物浓度的增加，其细胞的凋亡比例显著增加，呈药物剂量依赖性。从药物浓度与凋亡作用效果分析，30μg/mL莪术醇组是最佳浓度组[10-12]。

肿瘤的侵袭和转移是需要肿瘤细胞和肿瘤基质成分共同参与的主动过程，包括肿瘤细胞与细胞外基质的黏附，细胞外基质的降解，肿瘤细胞穿透并进入邻近组织[13]。肿瘤细胞可产生多种蛋白水解酶降解细胞外基质，因基质金属蛋白酶几乎能降解细胞外所有成分，故被认为是该过程中主要的蛋白水解酶。基质金属蛋白酶（MMPs）能促进肿瘤细胞突破细胞外基质的组织学屏障，向邻近组织侵袭和远处转移，几乎能降解细胞外基质中的各种蛋白成分和胞外蛋白，故被认为是侵袭过程中的主要的蛋白水解酶，其家族成员具有相似的结构，一般由5个功能不同的结构域组成。MMPs成员在上述结构的基础上各有特点。有研究发现，大肠癌中的MMP2的表达，可能是促使肿瘤发生、生长和浸润转移的重要因素，故可作为判断肿瘤恶性程度的重要指标。本实验通过Western Blot检测莪术醇作用于SGC-7901细胞后的MMP2的表达水平，观察发现不同浓度的莪术醇作用于SGC-7901细胞后，随着浓度的增大，MMP2蛋白表达水平明显降低，呈剂量依赖性，笔者认为其机制可能是莪术醇通过下调SGC-7901细胞中的MMP2蛋白表达水平，保护了基底膜的完整性，从而降低SGC-7901细胞降解细胞外基质的能力[14-15]。

NO在机体内以L-精氨酸为底物，在一氧化氮合成酶（nitric oxide synthase，NOS）催化作用下生成。肿瘤来源的NO在肿瘤细胞的增殖、生存、转移和侵袭方面表现为介导作用。NO对肿瘤的作用，有学者认为是促进，也有学者认为是抑制，这种矛盾的存在成了NO研究的热点。在肿瘤早期，NO可通过介导DNA损伤来参与肿瘤的形成过程，它通过诱导血管生成、刺激肿瘤细胞的侵袭性和调节免疫系统来促进肿瘤的生长、侵袭和转移。本实验采用一氧化氮试剂盒测定培养液上清中的NO含量，其原理是NO化学性质活泼，在体内代谢很快转化为NO2和NO3，而NO2又进一步转化为NO3-，NO2-的进一步转化，是利用硝酸还原酶特异性将NO3-还原为NO2-，通过显色深浅测定其浓度的高低。本实验采用一氧化氮试剂盒来检测莪术醇作用于SGC-7901细胞后，其细胞培养液上清中NO含量，结果发现莪术醇抑制了SGC-7901细胞的的NO的产生，与顾建华等证实的诱导型一氧化氮合酶选择性抑制剂氨基胍（AG）抑制鼠胃癌MFC细胞NO产生发挥抑制肿瘤细胞生长和增殖作用的结论相同。所以本实验在体外培养的单一环境中，莪术醇与SGC-7901胃癌细胞共同孵育的前提下，莪术醇抑制胃癌细胞生长和增殖的同时对NO也有抑制作用。随着莪术醇药物浓度组的增加，NO含量降低，从15μg/mL组到120μg/mL组的组间比较，差异有统计学意义，研究结果表明莪术醇通过量-效依赖性关系阻断NO产生，从而拮抗NO促瘤作用发挥抗肿瘤效应[16-19]。

通过以上实验研究显示莪术醇抑制了SGC-7901细胞中的MMP2的表达，同时降低了SGC-7901细胞的培养液上清中的NO含量，笔者认为：①可能是莪术醇抑制了MMP2破坏基底膜的Ⅳ型胶原，保护了基底膜的完整性，从而抑制了肿瘤细胞的侵袭和转移；②莪术醇作用于SGC-7901细胞后通过下调NO的产生，调节MMP2和其抑制剂TIMP2、TIMP3之间的平衡，从而抑制肿瘤细胞的侵袭和转移；③莪术醇作用于SGC-7901细胞后通过下调NO的产生，并以剂量依赖方式来拮抗NO促瘤作用，从而发挥抗肿瘤效应。有关莪术醇抗肿瘤的作用机制的深入研究正在探索之中。

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Prelim inary discussion on effect of curcumol in apoptosis,MMP2 and NO in SGC-7901 cells

XU Lichun CHEN Haiyan WEN Jie TAO Yaling
Cancer Prevention Research Center,Medical College of Yangzhou University,Jiangsu Province,Yangzhou 225001,China

Objective To discuss the effects of Curcumol on the apoptosis,MMP2 and NO of human gastric cancer cells(SGC-7901 cells).MethodsCurcumolwas dissolved in dehydrate alcohol and the initial concentration of Curcumolwas 9 mg/mL.Group 1,group 2,group 3,group 4 and group 5 were set up as experimental groups.The Curcumol concentrations were set as follows:7.5,15,30,60,120μg/mL,control group contained 1%dehydrate alcohol(dissolvent compare).The Trypan blueand method was used to analyze the cytoactive of SGC-7901;MTT assay was performed to study the inhibitory rate of SGC-7901 cells proliferation;the metastasis of SGC-7901 was described through the scratches experiment;the apoptosis rate were detected by FACSCalibur and the expression of Matrixmetalloproteinase 2 (MMP2)were detected by Western Blot.The content of NO in cell culturemedium was detected by NO kit.ResultsCurcumol had a good effect on drug concentration and restrain the tumor growth in 30μg/mL,and compared with controls,it had significant difference in restrain the proliferation of tumor cell(P<0.05);Curcumol could promote the apoptosis,it showed significant difference when compared with controls (P<0.05);Curcumol could make the expression of MMP2 protein descend to varying degrees,it had significant difference when compared with controls(P<0.05);this research showed with the increasing of the concentration of curcumol,the content of the NO in the supernate gradually reduced,it had significant difference when compared with controls(P<0.05).ConclusionCurcumol in 30μg/mL is the best efficacy group,it can significantly inhibit the proliferation of SGC-7901 cell,significantly promote the tumor cell apoptosis,significantly inhibit the expression of MMP2,reduce the content of NO in supernate,and express the series antitumor function.This study discusses the possible mechanism of curcumol cure the stomach cancer from cell and molecular level;provide the basis in theory and experiment for clinical application that Curcumol and its derivatives or structure analogues treat stomach cancer.

Curcumol;SGC-7901;Apoptosis;MMP2;NO

R000

A

1673-7210（2012）12（a）-0018-04

江苏省医学卫生重点基金资助项目（编号：K200511）。

徐立春，研究员，教授，主要从事肿瘤防治基础与临床方面的研究。

2012-07-02 本文编辑：冯 婕）