应用RT－PCR和荧光原位杂交监测急性早幼粒细胞白血病微小残留白血病

张 济，李 羿，李君君，颜家运，刘 静

（1.南华大学附属第一医院 血液科，湖南 衡阳421001；2.中南大学湘雅医学院分子生物学研究中心，湖南 长沙410078；3.空军雷达学院宜昌校区卫生队，湖北 宜昌443111）

急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia，APL）是一种特殊类型的急性白血病，发病率占急性白血病的6%－9%，在中国人群中约占急性髓系白血病的12%－23%［1］。70%－90%的APL具有特征性的染色体易位t（15；17）（q22；q12）及其产生的PML－RARα融合蛋白，是APL特有的分子遗传性学标志。此类白血病细胞可被全反式维甲酸（all trans retinoic acid，ATRA）诱导分化成熟，国内外许多研究学者［2－4］研究报道ATRA 和As2O3联合治疗急性早幼粒细胞白血病，可有效根除白血病细胞的恶性克隆，完全缓解率（CR）达85%－90%。本研究通过RT－PCR和荧光原位杂交技术检测ATRA及As2O3联合治疗APL后体内PML－RARα融合基因的表达水平变化，监测APL患者体内微小残留白血病的情况，为及时临床用药及预后评估提供实验依据。

1 资料与方法

1.1 对象 20例正常对照组为健康人群，男13人，女7人，年龄在15－62岁，中位年龄为38岁。46例APL患者为2008年6月至2010年6月我院诊治的病人，APL的诊断均依据FAB的诊断标准［5］，其中男26例，女20例，年龄16－65岁，中位年龄38岁。

1.2 治疗方法 将0.1%As2O3注射液10ml加入50g／L葡萄糖溶液500ml中，静脉点滴，持续4－6h；ATRA 25mg.m－2.d－1，口服，直至达完全缓解（CR）。完全缓解（CR）后再接受3个疗程化疗。

1.3 荧光原位杂交检测PML－RARα融合基因采用北京金菩嘉公司提供的双色双融合DNA探针，实验操作参考操作说明及文献资料［6］进行，结果观察在OLYMPUS－BX51型荧光显微镜下观察计数1000个细胞。正常细胞信号显示方式为2红2绿，PML－RARα融合基因融合基因阳性细胞为2红1绿1黄。

1.4 RT－PCR 检测 PML－RARα融合基因 采用TRIZOL试剂严格按操作说明提取患者总RNA，采用cDNA合成试剂盒进行逆转录反应，采用一对特异的PML－RARα融合基因引物扩增该融合基因，上游引物：5＇ACCGAT GGCTTCGACGAGTTC 3＇，下游引物：5＇AGCCCTTGCAGCCCTCACAG 3＇；PCR参数设置为：94℃变性35秒，55℃退火1分钟，72℃延伸3分钟，反应30个循环，最后1周期后72℃延伸10分钟，PCR产物经2%的琼脂糖凝胶电泳分析。

1.5 统计学处理 运用SPSS13.0统计软件进行分析，数据资料采用配对四格表资料检验（Mc－Nemar test）进行差异分析，检验水准为α＝0.05。

2 结果

2.1 治疗前骨髓细胞形态学与PML－RARα融合基因检测

46例患者初诊时骨髓细胞学检查为典型的APL骨髓象，异常早幼粒细胞占骨髓有核细胞的78.4±16.2%，RT－PCR及 FISH 技术检测 PMLRARα融合基因均为阳性，其中2例初发患者因并发弥散性血管内凝血（DIC）抢救无效死亡。

2.2 微小残留白血病的检测

2.2.1 诱导缓解后 PML－RARα融合基因的检测

经全反式维甲酸和三氧化二砷联合治疗后骨髓象达到完全缓解，其中34例APL患者PML－RARα融合基因检测结果见表1，25例经RT－PCR和FISH检测均呈阴性，1例患者缓解后未能严格按化疗方案坚持治疗，疾病复发而死亡，另外1例患者失去随访资料，其余病人一直处于缓解状态，因此该融合基因阴性复发APL的预测值为4.3%。9例PML－RARα融合基因阳性患者，3例FISH检测呈阴性，FISH的阳性检测失败率为33.3%；1例RTPCR检测呈阴性而FISH检测呈阳性，其检测失败率为11.1%，两法检测的灵敏度无显著差异（χ2＝0.25，P＞0.05）。融合基因阳性患者中4例患者最终复发APL，因此在此阶段PML－RARα融合基因检测阳性而复发APL的预测值为44.4%。

表1 诱导缓解后PML－RARα融合基因检测结果

2.2.2 巩固及维持治疗后PML－RARα融合基因的检测 APL患者治疗达CR，再经过连续3个月巩固化疗后，31例具有完整病历资料APL患者的PML－RARα融合基因检测结果见表2，27例融合基因阴性患者至今持续达到分子生物学缓解，无复发病例。4例PML－RARα融合基因阳性患者，2例FISH检测示阴性（阳性检测失败率为50%）；1例RT－PCR检测示阴性（阳性检测失败率为25%），3例患者最终复发APL，1例患者经治疗后缓解，因此在此阶段其融合基因阳性复发APL的预测值为75%。

表2 巩固维持治疗后PML－RARα融合基因检测结果

3 讨论

MRD是指白血病经过治疗达到完全缓解（CR）后体内残留白血病细胞的状态，它是导致白血病复发的主要根源。因此，MRD的早期检测是防止白血病复发和提高患者长期生存率的重要措施。MRD的检测方法包括细胞形态学、免疫学、细胞遗传学、聚合酶链反应（PCR）等。APL患者化疗前白血病细胞总数＞1012，化疗缓解后减少到108，形态学方法就难以检出MRD，常规细胞遗传学分析因分裂相数量和质量的限制，因此也不是检测MRD的敏感方法。PML－RARα融合基因是APL特征性的分子遗传学标志，对疾病的诊断、治疗及预后评估具有非常重要的临床价值。RT－PCR和FISH技术是临床上非常有效的PML－RARα融合基因检测技术，APL患者经ATRA和As2O3联合治疗后PML－RARα融合基因阴性的患者，仅有1例在诱导化疗结束后该融合基因呈阴性的患者在2年内出现了复发，在此阶段基因检测阴性复发APL的预测值仅为4.3%，而PML－RARα阳性复发APL的预测值为44.4%；而经巩固和维持治疗后，融合基因阴性的患者尚未见复发病例，PML－RARα阳性而复发APL的几率（75%）较诱导化疗结束时高，因此，PML－RARα基因阴性提示非常低的APL复发概率，而阳性则预示着较高的复发风险。Joseph等［7］研究结果显示PML－RARα融合基因检测2次以上阴性患者者，仅7%的患者发生复发，而2次以上阳性者，100%复发。

RT－PCR和FISH技术在实际应用过程中都存在各自的局限性，在发生隐性易位（包括插入易位和复杂易位）的患者中，若不使用特异性位点探针，FISH检测结果常为阴性［8］，本研究结果显示在诱导缓解和巩固维持治疗后其阳性检测失败率分别为33.3%和50%。而在RT－PCR反应体系中，高质量的RNA及高效的逆转录是实验成功的关键步骤［9］，若提取的RNA数量及质量达不到实验要求则是引起实验失败的主要原因，在前后两次检测中RT－PCR的阳性检测失败率分别为11.1%和25%，因而比较而言，RT－PCR对APL患者MRD监测的灵敏度较FISH稍高，但无统计学意义（P＞0.05），而FISH相对要求的分析细胞数量较少，且无论是分裂间期还是分裂期细胞均可获得准确结果，特异性高。因此，在实际临床实践中可使它们相互补充，可得到更全面准确的实验结果。

综上所述，RT－PCR和FISH技术是两种重要的监测APL患者体内PML－RARα融合基因表达情况的技术方法，准确而及时的PML－RARα融合基因的检测结果不仅对APL患者疾病的诊断具有重要价值，而且在APL患者微小残留病灶的监测发挥重要作用，并指导临床及时进行药物干预治疗，提高患者的长期生存率及改善患者生活质量。

［1］马 军.白血病［M］.北京：北京大学出版社，2007：24.

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［4］刘 元，沈志祥，陈 竺，等.全反式维 甲酸联合三氧化二砷治疗初发急性早幼粒细胞 白血病的近期疗效观察［J］.中华血液学杂志，2003，24（1），25.

［5］张之南.血液病诊断及疗效标准［M］.北京：科学出版社，1998：279－280.

［6］郎 丽，李惠民，刘 华，等.实时定量RT.PCR检测急性早幼粒细胞白血病PML－RARa融合基因［J］.中国实验血液学杂志，2007，15（4）：714.

［7］Jurcic JG，Nimer SD，Scheinberg DA，et al.Prognostic significance of minimal residual disease detection and PML／RAR－alpha isoform type：long－term follow－up in acute promyelocytic leukemia［J］.Blood，2001，98（9）：2651.

［8］Choughule A，Polampalli S，Amre P，et al.Identification of PML／RARa fusion gene transcripts that showed no t（15；17）with conventional karyotyping and fluorescent in situ hybridization［J］.Genet Mol Res，2009，8：1.

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