基质金属蛋白酶－9联合尿脱落细胞FISH检测诊断膀胱癌的价值

韩 永，徐燕杰，黄海燕，许晓光，蔡 明，石炳毅

（解放军第309医院全军器官移植中心研究室，北京100091）

膀胱移行上皮细胞癌（transitional cell carcinoma of bladder，TCCB）是泌尿外科最常见的恶性肿瘤，早期治疗愈后佳，5年生存率可达80%，晚期治疗疗效差，5年生存率仅50%［1］。膀胱镜检查及细胞形态学检测是最常用的诊断TCCB的方法，但细胞形态学检测敏感性低，膀胱镜检查因痛苦患者难以接受［1］。检测尿液中与膀胱癌发生相关的抗原诊断TCCB敏感性较低，易漏诊。应用尿脱落细胞荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization，FISH）检测3、7、9、17号染色体数目畸变诊断TCCB敏感度高、特异性强，且无创性，尤其对早期TCCB患者有辅助诊断作用，对TCCB的诊断具有重要价值［2－3］。

基质金属基质蛋白酶（matrix metallo－proteinases，MMPs）是人体内降解细胞外基质（extracellular marix，ECM）的主要酶类，而ECM 在肿瘤的侵袭和浸润过程中发挥重要的作用。MMP－9是MMPs家族中的重要成员之一，与多种肿瘤的恶性生物学表现以及预后密切相关［4，5］。本研究通过对100例TCCB患者及20例健康体检者采用EL ISA法检测血清MMP－9含量，同时联合荧光原位杂交技术检测尿脱落细胞，探讨二项联合检测诊TCCB癌的价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2007年1月－2008年4月在解放军总医院第二附属医院器官移植中心泌尿外科住院TCCB患者100例（膀胱癌组），诊断均经手术病理证实。男81例，女19例；年龄20－60岁，中位年龄52岁。肿瘤临床病理分级：T1－T2 47例，T3－T4 53例。对照组20例，男15例，女15例；年龄20－60岁，2组性别、年龄比较差异有无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 MMP－9检测 应用ELISA法，试剂盒购自美国ROCHE公司，按说明书进行操作。TCCB组于手术前检测。

1.2.2 FISH 采用多中心，双盲研究比较FISH和尿细胞学检查诊断肉眼和镜下血尿患者患TCCB的敏感性。血尿经过证实后，尿液标本被送往中心单位实验室，患者行膀胱镜检，膀胱镜下的可疑病变均取活检或者切除，病理标本诊断并分期分级（图1，图2）。荧光原位杂交（FISH），探针标记P16，3、7、17号染色体着丝粒试剂盒均购自北京金菩嘉医疗科技有限公司产品，－20℃保存备用。3、17号染色体着丝粒探针为绿色荧光信号，7号染色体着丝粒探针和杂交到9号染色体长臂（9q21）的P16探针为桔红色荧光信号。

收集受检者新鲜尿液后分为2份，1份按照试剂盒说明书方法进行FISH实验操作，另1份离心涂片（离心半径10cm，离心时间10分钟，2 500r／min），HE染色寻找肿瘤细胞。

间期FISH步骤：取出储存于－20℃的离心涂片标本，具体步骤参照试剂说明书，具体见文献［9］；

通过FISH点计数分析2.0软件控制的冷电荷耦合设备相机摄取图像，OLYMPUS BX51荧光显微镜，每组探针分析100－200个细胞。

1.3 结果判定 单体：单个信号的核比例＞15%；3倍体及多倍体：3个及多个信号的核比例＞10%细胞总数。组合探针（P16，3、7，17）阳性判定依据UroVysion推荐标准［7］：至少在4个细胞中同时存在3、7、17号染色体中的2个染色体的扩增，或至少在12个细胞中存在9p21纯合性缺失。尿脱落细胞学以发现肿瘤细胞为阳性，未发现肿瘤细胞为阴性。

1.4 统计学处理 采用SPSS 13.0软件进行统计分析，计量资料以均数标准差表示，组间比较采用t检验，计数资料采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组血清MMP－9水平比较 TCCB组与正常组比较，血清中 MMP－9水平明显升高（P＜0.001），相关性分析结果，年龄、性别、肿瘤类型因素与TCCB MMP－9阳性表达无明显相关（P＞0.05）。

2.2 2组FISH脱落细胞学检测结果比较 采集20个健康成人尿液，使用推荐方法制备玻片及进行CSP7／CSP3P16／CSP17的FISH检测。阈值测定每组探针组合分析200个细胞.统计出现不同异常情况的百分比.阈值＝ 平均数（M ）＋3x标准差（SD）。如果检测值大于阈值，判定为阳性结果。FISH检测出现2个红色信号的间期细胞为98.5%，3个红色信号的间期细胞数为（0.94±1.2）%。健康成人FISH结果显示各探针表现为2红、2绿2个杂交信号（图3）。在TCCB组，FISH结果可见不同程度的染色体数目异常（见图4）。对照组FISH及尿脱落细胞学检测结果均为阴性。TCCB组FISH检测全部为阳性（见图4）。TCCBFISH阳性表达相关性分析，年龄，性别，肿瘤类型因素与膀胱癌FISH阳性表达无明显相关（P＞0.05）。参数病理分级越高，FISH 阳性突变越高，表明TCCBFISH阳性表达呈现规律性量化改变，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表2。

2.3 不同病理学分级 膀胱癌患者血清中MMP－9水平比较随着肿瘤组织学分级增高，膀胱移行细胞癌血清中MMP－9含量依次升高，具有显著性差异（P＜0.001），见表1。

表1 对照组与不同组织学分级膀胱移行细胞癌血清MMP－9含量比较

2.4 相关分析结果 TCCB组血清MMP－9表达 与年龄，性别，肿瘤类型因素无明显相关（P＞0.01）。TCCB FISH阳性表达的相关性分析：年龄，性别，肿瘤类型因素与膀胱尿路上皮癌FISH阳性表达无明显相关（P＞0.05）。病理分级越高，FISH阳性突变越高，说明TCCB患者FISH阳性表达呈现出规律性的量化改变，差异显著（P＜0.01）（表2）。

3 讨论

目前，膀胱镜组织活检病理检查为诊断膀胱癌金标准，尿脱落细胞学、经腹部超声检查、尿核基质蛋白－2（NMP－2）、膀胱肿瘤抗原（BTA）及免疫细胞因子（ImmunoCyt）等肿瘤标记物是发现和检测TCCB的常用方法［6－8］。但膀胱镜为有创检查，严重时可导致出血、膀胱穿孔等并发症，患者不易接受，尤其对泌尿系统急性感染期、尿道狭窄、膀胱容量过小、出血性疾病、女性月经期及不能接受膀胱截石体位的患者无法行膀胱镜检查。膀胱镜视野也有一定盲区。尿脱落细胞形态学检查方法简单、无创，是诊断和术后随访的主要方法。但敏感性相对较低。

图1 尿路上皮癌Ⅲ级HE（100倍）

图2 尿路上皮癌Ⅲ级HE（400倍）

图3 正常人F ISH阴性

图4 尿路上皮癌FISH阳性

表2 研究组膀胱移行细胞癌FISH阳性表达的相关性分析

随着对TCCB遗传学改变的深入研究，人们发现9号染色体部分（如p16位点）或全部丢失是最常见遗传学改变，且这一改变与TCCB的早期发生密切相关。此外，TCCB的发展与染色体不稳定性也紧密相连，尤其是与3，7号及17号染色体的非整倍性密切相关［1］。对尿液或膀胱冲洗液中细胞进行以上遗传学改变的检测对TCCB的早期诊断及病程监测有较大价值，其灵敏度高于细胞形态学检测，特异性则与细胞形态学检测相当。Halling等［9］对265例患者在TCCB检查前检测上述指标，诊断TCCB的敏感性为81%，特异性为100%。Skacel等［10］报道，对尿脱落细胞学检查不确定或非典型性改变的标本再行检测，敏感性可达100%，特异性达89%。因此，对于细胞学检查不确定的病例，可作为一项检测手段。而Yoder等［11］研究结果认为，对于尿脱落细胞学检查诊断模糊或不典型的病例，检测可以明确TCCB的诊断，无需行膀胱镜检查。本研究结果显示，随着肿瘤级别的增高，FISH灵敏度也随之升高。

有研究结果证实［9－11］，使用尿脱落细胞荧光原位杂交技术检测3、7、9、17号染色体数目畸变诊断膀胱移行细胞癌具有敏感度高、特异性强的优点，并具无创性，尤其对早期尿路上皮癌患者有辅助诊断作用，对TCCB的诊断具有重要的临床应用价值。目前FISH技术复杂还不够成熟，检测费用亦较高，时间周期长（3－4天），临床中还未大量开展开展肿瘤的FISH检测。

侵袭和转移是恶性肿瘤的主要特征，是肿瘤细胞、宿主细胞及细胞外基质（ECM）之间一系列复杂、多步骤相互作用的结果，其中肿瘤细胞与细胞外基质间相互作用在这一过程中起着关键作用，而MMPs几乎降解ECM的所有成分，从而促进癌细胞对周围正常组织的侵袭，导致肿瘤的扩散和转移［11］。已有研究结果［12，13］发现，血清中 MMPs及其他细胞因子水平可够反映组织中的表达情况，通过测定血清中的水平，评价其在肿瘤生长中的作用。本研究通过对血清MMPs水平的测定也证实了上述结果。膀胱移形细胞癌组血清MMP－9水平明显高于正常对照组。此外发现随着肿瘤临床分期的增高，浸润性膀胱移行细胞癌患者血清中的 MMP－9浓度明显高于浅表性膀胱肿瘤，分析其可能与浸润性膀胱肿瘤更易膀胱异位复发有关。本研究还对不同组织学分级的膀胱移形细胞癌患者血清中的MMPs进行测定，发现上述指标随肿瘤病理学分级的增加而增高。国外研究表明在测定肺癌［14］、乳腺癌［15］患者血清 MMPs含量时，发现随着肿瘤分期及级别升高，浓度明显升高，与本研究结果一致。肿瘤组织中均存在MMPs的高表达，由于组织中MMPs的高表达，明胶酶MMPs通过降解毛细血管和淋巴管基底膜，导致肿瘤进入循环中，肿瘤细胞再分泌 MMPs，引起远处转移［16－19］。血清中 MMPs高含量可能与膀胱肿瘤的侵袭转移及高复发率有关，并提示预后不良。综上所述，MMPs参与了膀胱肿瘤的早期发生、发展，并与肿瘤的浸润转移有关，MMPs的血清学检测，直接反映血清中的浓度，其含量的测定可作为判断膀胱移形细胞癌预后的重要指标之一。

荧光原位杂交，基质金属基质蛋白酶水平联合检测对膀胱癌的诊断有重要参考价值，弥补了单独检测荧光原位杂交的不足。肿瘤标志物联合检测的最大意义在于增加肿瘤检出的线索，为临床诊断、早期治疗提供了重要的参考价值，并可能作为判断膀胱移形细胞癌预后的重要指标。

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