皮肤鳞癌组织中P14ARF、E-CAD、FOS和JUN基因甲基化状态的分析

王 亮，孙 然，张亚芹，丛宪玲＊

（1.吉林大学中日联谊医院，吉林 长春130033；2.吉林大学第二医院，吉林 长春）

皮肤鳞癌（Skin squamous cell carcinoma）是发病率较高的皮肤恶性肿瘤。皮肤鳞癌在皮肤恶性肿瘤中占有较大比例，一般为80%至90%［1］，其发病率有逐年增高趋势，在老年人中尤其明显。最新的研究表明，人类肿瘤的发生、发展与DNA的甲基化异常修饰有关，基因的甲基化异常可以先于肿瘤的发生而存在，因此对人体肿瘤易感基因进行早期的甲基化状态检测，可以有效地预防恶性肿瘤的发生。此外，DNA甲基化检测的优势还在于取材不仅可以用于肿瘤组织本身，也可以应用于血清等体液组织［2－3］，具有简便通用的操作特点。

本实验通过甲基化特异性PCR（MSP），对抑癌基因p14ARF、E－cad及原癌基因FOS、JUN启动子区域CpG岛的甲基化状态进行定性的检测，以明确两种与鳞癌有关的抑癌基因和原癌基因启动子区的甲基化变化，进而深入的研究皮肤鳞癌的产生机理并为其早期诊断开辟新的途径。

1 材料与方法

1.1 组织标本 实验所用标本均来自吉林大学中日联谊医院组织标本库2009年11月－2011年11月收集的住院患者的皮肤组织，其中皮肤鳞状细胞癌组织标本30例，男性17例，女性13例，年龄27～75岁，平均年龄61岁；正常皮肤组织标本20例，男性6例，女性14例，年龄14～56岁，平均年龄24.3岁。所有标本取材均具备知情同意书，经我院伦理委员会审批并经病理组织形态学检查确认。

1.2 组织DNA的抽提 采用 Wizard Genomic DNA Purification Kit（Promega公司）试剂盒，按照说明书抽提DNA。

1.3 对上述提取的DNA进行MSP实验

1.3.1 DNA的亚硫酸盐修饰 首先采用基因组DNA 修饰试剂盒（EZ－DNA Methylation Gold Kit公司）对组织DNA进行亚硫酸盐修饰，具体过程严格按照说明书操作。

1.3.2 原癌基因引物设计 通过UCSC网站对FOS、JUN基因进行序列检测，采用Methprimer网站软件程序对原癌基因FOS、JUN的启动子区进行甲基化引物的设计。（具体序列见表1）。

表1 FOS、JUN基因MSP引物序列

1.3.3 PCR扩增 （1）以亚硫酸盐修饰后的DNA作为模板，利用甲基化和非甲基化特异性引物通过热启动PCR（Bio－Rad Mycycler PCR）扩增基因启动子区片段，反应总体系25μl，体系中含有亚硫酸盐修饰后的模板DNA 2μl；2×GC BufferⅠ2.5μl，20 μmol／L引物各0.5μl（原癌基因引物为本实验室独立设计，由上海生工公司合成，见表1），LA Taq Hot Start酶0.25μl，dNTP 4.0μl，灭菌双蒸水5.25μl。

（2）PCR反应条件为95℃预变性10min；95℃变性30s、60℃退火30s（p14ARF）［57℃30s（E－cad）；58℃30s（FOS）；55℃30s（JUN）］、72℃延伸60s，共30个循环；最后在72℃条件下延伸7min。

（3）取PCR产物10μl上样，在3.0%的琼脂糖凝胶中电泳，通过EB染色的凝胶 在UVI－FIRE－READER凝胶成像系统中显像。抑癌基因p14ARF、E－cad以甲基化引物出现产物条带判断为阳性（M），以非甲基化引物出现产物条带判断为阴性（U）；原癌基因FOS、JUN以非甲基化引物出现产物条带判断为阳性（U），以甲基化引物出现产物条带判断为阴性（M）。

1.4 统计学分析 使用SPSS 16.0统计软件，采用χ2检验进行统计分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

30例皮肤鳞癌组织中p14ARF、E－cad基因高甲基化分别为18例（60.0%）和11例（37.6%），而20例正常组织分别为1例（5.0%）和2例（10.0%）；30例皮肤鳞癌FOS、JUN基因非甲基化分别为22例（73.3%）和25例（83.3%），20例正常组织非甲基化分别只有6例（30.0%）和1例（5%）。（表2）。皮肤鳞癌患者抑癌基因p14ARF和E－cad两个基因启动子CpG岛可见明显甲基化，原癌基因FOS、JUN启动子区域CpG岛甲基化率很低，这些对于皮肤鳞癌诊断及判断预后有重大意义。

表2 p14ARF、E－cad、FOS和JUN基因 MSP结果分析

3 讨论

皮肤及其他系统肿瘤中抑癌、原癌基因启动子区存在异常甲基化现象。由于CpG岛的局部异常甲基化早于细胞的恶性增生，因此甲基化的诊断可以用于肿瘤发生的早期预测［4］。

p14ARF属于细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白基因家族，其产物P14蛋白是通过Rb和P53基因途径抑制组织细胞从Gl期向S期过渡的细胞周期复性调节因子，在抑制肿瘤的发生发展中发挥重要的作用。据报道，该基因失活与多种肿瘤的发生关系密切，如膀胱癌、口腔鳞癌、结肠癌等［5，6］。此外有研究表明该基因失活可以与EB病毒感染协同作用，进一步促使胃肠道肿瘤的发生［7］。E－cad基因是细胞粘附素家族中的成员，其表达产物可以维持上皮细胞结构的稳定，使上皮细胞之间连接紧密，细胞不易脱落。该基因失活会促使肿瘤细胞发生迁移。子宫内膜癌患者体内E－cad基因表达减低后，5年生存率会受到明显的影响［8］。

图1 抑癌基因p14ARF、E－cad及原癌基因FOS、JUN甲基化状态图

FOS、JUN基因编码的是核内特异性转录因子，这两种基因受RAS通路介导，与肿瘤的产生关系密切。近些年的研究表明，FOS、JUN两种基因活化在鳞癌的生成中扮演者重要的角色，归属于原癌基因的范畴。通过对小鼠子宫肿瘤研究发现，FOS基因第4外显子低甲基化导致其过表达，进而促进子宫鳞癌的发生［9］。在口腔鳞癌和皮肤鳞癌的患者中，JUN 基因的高表达现象更为明显［9，10］。

我们的结果显示，皮肤鳞癌组织中存在FOS、JUN两种原癌基因的低甲基化状态。此两种基因的低甲基化与其活化可能存在一定的联系。肿瘤的发生发展是多基因协同作用的结果，通过实验结果，我们推测抑癌基因p14ARF、E－cad的高甲基化和原癌基因FOS、JUN的低甲基化协同作用，共同导致皮肤鳞癌的发生。我们进一步推测，抑癌基因的高甲基化导致癌前病变的发生，而原癌基因低甲基化最终促使肿瘤的生成。这也提示我们上述4种基因片断可结合在一起作为皮肤鳞癌诊断的标志。

综上所述，p14ARF、E－cad、FOS、JUN 基因启动子区的异常甲基化与皮肤鳞癌的发生有一定的联系。4种基因甲基化联合检测可以应用于皮肤鳞癌的诊断及预后判断，然而抑癌基因高甲基化与原癌基因低甲基化之间相互协同机制等若干问题，仍需要扩大组织样本量，并通过周密的实验设计，进行下一步的研究。

［1］Kraljik N，Rosso M，Ageel A，et al.The incidence of skin squamous cell carcinoma in Osijek－Baranja County－－an epidemiological study［J］.Coll Antropol，2011，35（2）：77.

［2］Chan KC，Lai PB，Mok TS，et al.Quantitative analysis of circulating methylated DNA as a biomarker for hepatocellular carcinoma［J］.Clin Chem，2008，54（9）：1528.

［3］Yu J，Zhu T，Wang Z，et al.A novel set of DNA methylation markers in urine sediments for sensitive／specific detection of bladder cancer［J］.Clin Cancer Res，2007，13（24）：7296.

［4］Kawamoto K，Enokida H，Gotanda T，et al.p16INK4aand p14ARF methylation as a potential biomarker for human bladder cancer［J］.Biochem Biophys Res Commun，2006，339（3）：790.

［5］Kominami K，Nagasaka T，Cullings HM，et al.Methylation in p14（ARF）is frequently observed in colorectal cancer with low－level microsatellite instability［J］.J Int Med Res，2009，37（4）：1038.

［6］Kordi－Tamandani，Moazeni－Roodi A，Rigi Ladez MA.Analysis of methylation patterns and expression profiles of p14ARF gene in patients with oral squamous cell carcinoma［J］.Int J Biol Markers，2010，25（2）：99.

［7］Helene G，Axel z H，Helmut E，et al.EBV－infection in cardiac and non－cardiac gastric adenocarcinomas is associated with promoter methylation of p16，p14and APC，but not hMLH1［J］.Cellular Oncology，2010，33143.

［8］Yi TZ，Guo J，Zhou L，et al.Prognostic value of E－cadherin expression and CDH1promoter methylation in patients with endometrial carcinoma［J］.Cancer Invest，2011，29（1）：86.

［9］Li S，Hansman R，Newbold R，et al.Neonatal diethylstilbestrol exposure induces persistent elevation of c－fos expression and hypomethylation in its exon－4in mouse uterus［J］.Mol Carcinog，2003，38（2）：78.

［10］Renata R A，Elisa D S，et al.Correlation between c－Jun and human papillomavirus in oral premalignant and malignant lesions［J］.Oral Oncology，2008，44：698.