利用显色法快速筛选大豆脂肪氧化酶缺失突变体

董德坤 姜 莹，2 傅旭军 黄英运 袁凤杰 朱丹华

利用显色法快速筛选大豆脂肪氧化酶缺失突变体

董德坤1姜 莹1，2傅旭军1黄英运1袁凤杰1朱丹华1

(浙江省农业科学院作物与核技术利用研究所1，杭州 310021)
(深圳华大基因研究院2，深圳 518083)

以杭州国家大豆改良分中心保存的野生和栽培大豆资源为研究材料，利用显色法对大豆脂肪氧化酶自然缺失突变体进行筛选。从348份种质中发现同时缺失大豆脂肪氧化酶Lox1和Lox2的野生大豆种质1份ZYD04511，同时缺失大豆脂肪氧化酶Lox2和Lox3野生大豆种质1份ZYD04452，以及缺失大豆脂肪氧化酶Lox2或其含量极低的栽培大豆种质5份:ZDD06271、ZDD06044、ZDD13834、ZDD06245和VP35。试验结果同时表明显色法是一种简便快速的大豆脂肪氧化酶缺失突变体筛选方法。

大豆 脂肪氧化酶 突变体 显色法

大豆脂肪氧化酶(Lipoxygenas，EC1．13．11．12，简称Lox)是一类含非血红素铁、不含硫的蛋白质，分子质量为94～97 ku。在成熟大豆种子中约占总蛋白的1%～2%。它能催化具有顺，顺－1，4－戊二烯结构的多元不饱和脂肪酸的加氧反应，如亚油酸、亚麻酸等生成具有共轭双键的脂肪酸氢过氧化物，如乙醛和茉莉酮酸脂等，这些挥发性物质导致大豆及其制品产生豆腥味［1－3］。Theorell等［4］和Christopher等［5］先后分离纯化了大豆脂肪氧化酶的3种同功酶Lox－1、Lox2和Lox3(Lox3a、Lox3b)。在形成豆制品挥发性气味物质和豆腥味物质中，Lox2起主要作用，Lox1和Lox3作用相对较小［6－8］。Lox2缺失时豆腥味明显降低，Lox2和Lox3同时缺失几乎没有豆腥味，当Lox全缺失时根本不产生豆腥味［9］，并且Lox的缺失对大豆的性状并无显著影响［10］。

大豆加工过程中消除大豆脂肪氧化酶的主要手段包括高温加热处理、微波处理、有机溶剂萃取和水解酶处理等［11］。但是在处理的过程中大豆蛋白质品质会受到影响，其溶解度、黏性等特性降低或丧失;其他营养成分如维生素等也会受到破坏;同时加工的过程还增加了能量的消耗和生产成本的投入。而研究表明，使用Lox缺失大豆制作的豆制品不仅豆腥味低，而且具有较高的蛋白质水平、VE含量和清除DPPH自由基的活性［12］。因而筛选大豆脂肪氧化酶缺失种质用于优良品种的选育将是一种十分有效的解决豆腥味问题的途径。

本试验采用显色法对杭州国家大豆改良分中心保存的野生和栽培大豆种质进行分析筛选，以期获得大豆脂肪氧化酶缺失的优良种质。

1 材料与方法

1．1 试验材料

从浙江省农业科学院杭州国家大豆改良分中心保存的野生和栽培大豆资源中随机选取348份种质用于脂肪氧化酶缺失突变体的筛选。

大豆脂肪氧化酶缺失对照分别为:脂肪氧化酶全缺失品种大青豆(缺Lox1，2，3)记为L0;Lox2和Lox3缺失品种‘五星一号’记为L1;Lox2缺失品种‘五星二号’记为L13。其中‘五星一号’和‘五星二号’由河北省农业科学院张孟臣研究员惠赠。

1．2 试剂与溶液配制

亚油酸、吐温、次甲基蓝、二硫苏糖醇(DTT)、硼砂、硼酸磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、Tween20:上海生工生物工程技术有限公司;β－胡萝卜素:Sigma－Aldrich公司;其他试剂均为分析纯。

SLS(亚油酸钠底物)溶液:分别称取70．0 mg亚油酸钠和70．0 mg Tween20，将其溶于4．0 mL水中，混合均匀后加0．55 mL 0．5 mol/L的氢氧化钠溶液直到澄清，加蒸馏水定容至25．0 mL，抽真空处理，而后进行分装，液氮冷冻后置－80℃冰箱保存备用。

β －CS(β －胡萝卜素底物)溶液:称取10．0 mg β－胡萝卜素，加入10．0 mL丙酮，充分溶解后滤纸过滤，再加入与滤液等量的丙酮将其稀释成50%饱和溶液，棕色瓶4℃保存。

分别配制0．2 mol/L pH=9．0的硼酸钠缓冲液、0．2 mol/L pH=6．0的磷酸钠缓冲液和0．2 mol/L pH=6．6的磷酸钠缓冲液备用。

Lox1检测溶液:分别取25．0 mL 0．2 mol/L pH=9．0的硼酸钠缓冲液、5．0 mL 100μmol/L次甲基蓝溶液、5．0 mL SLS溶液和5．0 mL蒸馏水，混匀。

Lox2检测溶液:先将154．25 mg DTT溶于25．0 mL 0．2 mol/L pH=6．0的磷酸钠缓冲液，而后加入5．0 mL 100μmol/L次甲基蓝溶液、5．0 mL SLS溶液和5．0 mL丙酮，混匀。

Lox3检测溶液:分别取25．0 mL 0．2 mmol/L pH=6．6的磷酸钠缓冲液、5．0 mLβ－CS溶液、5．0 mL SLS溶液和5．0 mL蒸馏水，混匀。

1．3 样品制备

大豆种子磨粉，过60目筛备用。每份参试品种称取15．0 mg、30．0 mg和15．0 mg豆粉，分别置于编号为1、2、3的2．0mL干净离心管中。在1号管中加入1．5 mL 0．2 mol/L pH=9．0的硼酸钠缓冲液，在2号管中加入1．5 mL 0．2 mol/L pH=6．0的磷酸钠缓冲液，在3号管中加入1．5 mL 0．2 mol/L pH=6．6的磷酸钠缓冲液，轻摇混匀，4℃静止提取1h，然后4℃，12 000 r/min离心5 min，取上清液用于下一步检测反应。

1．4 显色法

参照Suda等［13］和Narvel等［14］，略有改进。

取1号管上清液0．5 mL，加入1 mL Lox1检测溶液，混匀，反应5 min后观察颜色变化;取2号管上清液0．5 mL，加入1 mL Lox2检测溶液，混匀，反应10 min后观察颜色变化;取3号管上清液0．5 mL，加入1 mL Lox3检测溶液，混匀，反应10 min后观察颜色变化;以上检测均以0．5 mL水代替上清液作为空白对照;显色反应温度控制在25～35℃之间。

1．5 分光光度计法

参照Suda等［13］和Narvel等［14］，略有改进。

取1号管上清液0．8 mL，加入Lox1检测溶液1．6 mL，混匀后立即放入分光光度计中，记录A660变化，检测时间5 min;取2号管上清液0．8 mL，加入Lox2检测溶液1．6 mL，混匀后立即放入分光光度计中，记录A660变化，检测时间10 min;取3号管上清液0．8 mL，加入Lox1检测溶液1．6 mL，混匀后立即放入分光光度计中，记录A452变化，检测时间5 min;以上检测均记录每隔10 s的动态变化数据。

1．6 数据统计

分光光度计法记录的动态变化数据利用Origin-Pro 7．5软件进行绘图。

2 结果与分析

2．1 显色法筛选脂肪氧化酶缺失突变体

大豆脂肪氧化酶Lox1显色法检测结果显示，当1号管提取液与Lox1检测溶液充分反应后，在所有对照中(空白对照、L0、L1、L13)中，空白对照和L0(缺Lox1、Lox2、Lox3)保持不褪色(蓝色)，而L1(仅含Lox1)、L13(含Lox1、Lox3)由于均含有Lox1而褪色。在被测试的348份样品中，仅发现野生大豆种质ZYD04511保持为蓝色(图1a)，表明ZYD04511可能为Lox1缺失种质。

同样，当2号管提取液与Lox2检测溶液充分反应后，空白对照、L0保持为蓝色，L1和L13溶液颜色稍淡。从348份种质中找到2份野生大豆(ZYD04452、ZYD04511)和5份栽培大豆(VP35、ZDD06271、ZDD13834、ZDD06245和ZDD06044)显示为蓝色或淡蓝色(图1b)，表明其可能为Lox2缺失种质或Lox2含量较低。而VP32则完全褪色，表明其可能含有Lox2。

当3号管提取液与Lox3检测溶液充分反应后，空白对照和L0(脂氧酶全缺)保持为黄色，L1(缺Lox2、Lox3)稍有褪色，显淡黄色。而L13(含Lox1、Lox3)由于含有Lox3而完全褪色。同样在348份种质中仅筛选到一份Lox3缺失种质——野生大豆ZYD04452，保持为同Lox3缺失对照一样的黄色。

图1 部分大豆种质脂肪氧化酶显色反应结果

表1 筛选获得的脂肪氧化酶缺失种质

2．2 分光光度计法检测分析

图2a反映了包括上一步显色法筛选得到的缺失种质和一些脂肪氧化酶不缺失种质Lox1检测反应中吸光度的动态变化情况。其中，野生大豆种质ZYD04511与Lox1缺失对照L0随时间延长吸光度无明显变化，说明ZYD04511可能缺失脂肪氧化酶Lox1。而其他种质吸光度下降明显，这些种质根据吸光度动态变化趋势大致可分为两组:第一组，吸光度在很短时间内迅速降至最低，表明Lox1催化活力较高，主要包括对照L13、VP32、VP35、ZDD13899和ZDD21255;第二组，在整个测定过程中吸光度呈缓慢下降趋势，当检测时间延长至600 s时，吸光度均降至与第一组一致的水平(数据未显示)，表明该组种质Lox1催化活力较低。

图2b反映了分光光度计法检测Lox2时吸光度的动态变化。ZYD04452、ZYD04511、ZDD06044、ZDD13834、ZDD06245、ZDD06271、VP35及对照L0吸光度随时间延长无明显变化，表明这些种质可能缺失Lox2或其含量极低，与显色法检验结果相符。对照品种L1吸光度随时间缓慢下降，其变化幅度大于对照L0但远远小于吸光度明显下降的种质;而对照L13在约250 s时吸光度有明显下降，但600 s时仍保有较高的吸光度;这与显色反应时L1和L13稍有褪色结果一致，说明L1和L13种质大豆脂肪氧化酶Lox2可能并不是完全缺失。其余参试种质吸光度随时间延长明显下降，导致其最终褪色，说明其Lox2催化活力较高。

图2c反映了分光光度计法检测Lox3时吸光度的动态变化。图中参试种质明显可以分为3组:第1组，ZYD04452与对照L0、吸光度随时间变化不明显，推测其脂肪氧化酶Lox3缺失，而L1吸光度有缓慢下降的趋势，与显色法L1黄色变浅的结果一致;第2组，包括ZYD04511、ZDD06245、ZDD06044、ZDD13834、ZDD06271和VP35，在检测的300 s时间内吸光度呈缓慢下降趋势，表明其Lox3催化活力较低;而第3组，包括对照L13、VP32、ZDD21255、ZDD13899和ZDD06140，其吸光度在50 s左右时间内迅速降至最低后趋于平稳，表明其Lox3催化活力较高。

图2 分光光度法检测大豆脂肪氧化酶时吸光度动态变化

通过显色法和分光光度法从384份材料中筛选得到7份大豆脂肪氧化酶缺失种质。其中2份为野生大豆种质，3份为夏大豆类型，1份为春大豆，1份为鲜食(菜用)大豆，种质相关信息见表1。

3 讨论与结论

由于与大豆及其制品豆腥味的形成等有关，所以大豆脂肪氧化酶在育种中备受重视。依据其蛋白的物理、化学性质以及在氧化底物过程中产生的特殊物质的特性等的差异进行分析测定。测定方法除了本研究应用的显色法和分光光度法外还包括氧电极法、ELISA法、色谱法、SDS－PAGE、IEF－PAGE、分子标记法等［18－21］，后面几种方法虽然各有优点，但也存在检测特异性和可靠性低、反应要求高或者试验成本高等不同的问题［21］。

显色法是根据大豆脂肪氧化酶最适反应pH值不同，采用相同底物、不同pH缓冲液环境分别检测这3种脂肪氧化酶［13－14］。本研究以次甲基蓝作为大豆脂肪氧化酶Lox1和Lox2检测指示剂;由于Lox2、Lox3最适反应pH相近，因而采用胡萝卜素作为Lox3检测的指示剂可以对Lox2和Lox3进行区分［13］。显色法具有迅速灵敏、操作简单、结果直观等优点，可用于大豆脂肪氧化酶缺失突变体的定性分析［22］，这些优点也在本研究中得到进一步的验证。

杨柳等［22］同时采用与本文相似的显色法和薄层凝胶电泳法可对大豆脂肪氧化酶缺失体进行检测，认为显色法检测Lox1和Lox2时快速、稳定，与本文结论一致;而检测Lox3时反应时间(平均15 min)远远长于本研究(约5 min)且结果不稳定，可能是由于样品提取时间短(3～10 min)，导致Lox3提取不完全的原因。

分光光度法也是一项简便易行的检测脂肪氧化酶的方法之一，但是有学者认为分光光度法检测脂肪氧化酶时要求提取物纯度较高，并且不适合大豆未脱脂样品等［13，21］。而本试验以未脱脂大豆粉为研究对象，其检测仍令人满意，并与显色法检测结果相互验证。说明这两种方法均具有操作简便、成本低等优点。考虑到检测时间和通量的问题，建议实际操作中采用显色法进行大豆脂肪氧化酶缺失种质的筛选。

本研究利用显色法和分光光度法从348份种质中筛选到7份大豆脂肪氧化酶缺失种质。其中野生大豆种质ZYD04511同时缺失脂肪氧化酶Lox1和Lox2。由于控制大豆脂肪氧化酶Lox1和Lox2的显性基因Lx1和Lx2是紧密相斥连锁基因［1］，Lox1和Lox2同时缺失种质很难获得，所以这份野生大豆种质显得尤为珍贵，可用于进一步的研究和利用。而筛选得到的脂肪氧化酶缺失的栽培品种，则可以根据其品种特性直接或间接用于粒用或鲜食大豆品种的改良。

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Rapid Screening of Soybean Lipoxygenase Lacking Mutants Using Colorimetric Assay

Dong Dekun1Jiang Ying1，2Fu Xujun1Huang Yingyun1Yuan Fengjie1Zhu Danhua1
(Institute of Crop and Nuclear Technology Utilization，Zhejiang Academy of Agricultural Sciences1，Hangzhou 310021)
(Beijing Genomics Institute at Shenzhen2，Shenzhen 518083)

Lipoxygenase is one of the important anti－nutritional factors in soybean．Screening and utilization of lipoxygenase lacking mutants will greatly facilitate the improvement of soybean qualities．In this study，348 soybean germplasms from Hangzhou Sub－center of National Soybean Improvement were screened for lipoxygenase lacking mutants using colorimetric assay．One wild soybean germplasm ZYD04511 was found lacking Lox1 and Lox2;another wild soybean germplasm ZYD04452 was found lacking Lox2 and Lox3;five landraces，ZDD06271，ZDD06044，ZDD13834，ZDD06245 and VP35 showed extremely lower Lox2 content or were lacking of Lox2．Results also show that the colorimetric assay is a simple and rapid method for screening of lipoxygenase lacking mutants in soybean．

soybean，lipoxygenase，mutation，colorimetric assay

S565．1

A

1003－0174(2012)07－0110－05

浙江省公益性项目(2011C22058)

2011－10－08

董德坤，男，1978年出生，博士，大豆分子育种

朱丹华，男，1957年出生，研究员，大豆遗传育种