鸭髓样分化因子MyD88部分cDNA克隆及组织表达图谱分析

郭智莉，周作勇，聂 奎

（1.西南大学动物科技学院，重庆 北碚400715；2.西南大学荣昌校区动物医学系，重庆 荣昌402460）

髓样分化因子MyD88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）最初被认为是一种髓样分化标记蛋白。1990年，Load发现了髓样分化基因家族成员中的新基因MyD88［1］。MyD88是Toll样受体（Toll－like receptors，TLRs）信号转导通路中关键的转接分子，具有使核转录因子κB（nuclear factor κB，NF－κB）活化转位进核，表达一系列特定的基因和致炎因子，如 TNF－α、IL－1和IL－18等。MyD88基因编码蛋白具有3个功能区域：N端的死亡结构域、中间区域及c端的TIR结构域。有文献表明，MyD88作为胞内能够介导10个TLRs家族的信号传导［2］。在人和鼠TLRs研究中发现，MyD88激活NF－κB途径介导了系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎等自身免疫性疾病的发生［3］，还导致心肌肥大［4］、参与了呼吸道炎症反应［5］和动脉粥样硬化斑块形成［6］等。

迄今为止，多个哺乳动物、鱼类、鸟类和无脊椎动物的MyD88分子已被鉴别，但是有关鸭的MyD88分子却未见报道。本试验以樱桃谷鸭为试验对象，对鸭MyD88部分cDNA进行克隆及生物信息学分析，并对MyD88mRNA在鸭不同组织中的转录情况进行检测。

1 材料与方法

1.1 试验动物 10日龄樱桃谷鸭，购自重庆荣昌某鸭厂。

1.2 主要试剂 大肠埃希菌DH5α为本实验室保存；RNAisoTMPlus、Taq酶、pMD 19－T、X－gal、RTPCR试剂盒、Amp，购自TaKaRa公司；胶回收试剂盒，购自OMEGA公司。

1.3 引物设计与合成 参照GenBank中已发表的鸡（NM＿001030962）、人（NM＿001172568）、家鼠（NM＿198130）的 MyD88CDS序列，用DNAStar软件进行相似比对，在保守序列中用Primer5.0设计cDNA 引物，MyD88：F0 5′－GTTGGAGCAAACGGAGTTCA－3′，R0 5′－CCTGGGGAAAGACTAAGAGCA－3′，扩增片段为195bp；参照鸭（AY43－6595）GAPDH 基因序列设计引物，GAPDH：F1 5′－GCCCAGAACATTATCCCA－3′， R1 5′－AGGTCAGGTCCACGAACA－3′，扩增片段为152bp；由Invitrogen（上海）公司合成引物。

1.4 总RNA的提取 采鸭心脏、肝脏、脾脏等7种组织各0.1g。参照TaKaRa公司的RNAisoTMPlus试剂说明书提取各组织的总RNA，用1%琼脂糖凝胶电泳检验RNA完整性。－70℃保存备用。

1.5 RT－PCR扩增 以鸭组织总RNA为模板，按RT－PCR的方法扩增目的片段。cDNA反转录体系（10μL）：5×Prime ScriptTMBuffer 2μL，Prime ScriptTMRT Enzyme Mix I 0.5μL，Oligo dT Primer（50μmol／L）0.5μL，Random 6mers（100μmol／L）0.5μL，Total RNA 3μL，RNase Free dH2O 3.5μL，37℃15min，85℃5s。PCR体系（25μL）：cDNA 2μL，10×Buffer 2.5μL，dNTP Mixture 0.5μL，Mg2＋1μL，引物F和 R各加入0.5μL，rTaq酶0.25μL，灭菌dH2O至25μL；扩增参数为：94℃预变性5min；94℃30s，60℃30s，72℃30 s，30个循环；72℃延伸5min。

1.6 目标基因的克隆及测序 将50μL RT－PCR产物经电泳后，按胶回收试剂盒回收目的片段。连接体系（10μL）：4.2μL回收产物，0.8μL pMD 19－T，5μL SolutionⅠ，混匀4℃连接过夜；转化入100 μL DH5α感受态细胞，冰浴30min，42℃热冲击90 s，冰浴2min，加入890μL LB液体培养基，37℃振荡培养1.5h后将菌液涂于含IPTG＋X－gal＋Amp的LB固体培养基上，37℃过夜培养；挑选阳性单菌落接种于含Amp的LB液体培养基，37℃振荡过夜，菌液PCR鉴定后，送阳性克隆至Invitrogen（上海）公司测序。

1.7 序列分析 将测序所得部分cDNA序列在GenBank数据库中进行BLAST初步比较分析，利用DNAStar软件推测目的片段所编码的氨基酸序列，并用Clustal W方法比对目的氨基酸片段与其他物种MyD88氨基酸片段的同源性，建立系统进化树。

2 结果

2.1 鸭MyD88RT－PCR检测结果 以鸭脾脏cDNA为模板，采用RT－PCR方法扩增MyD88目的片段，经3%琼脂糖凝胶电泳后出现1条特异性条带，长度为195bp（图1）。将纯化的目的片段克隆到载体，重组质粒经菌液PCR鉴定，得到预期大小目的片段，命名为pMyD88。

图1 MyD88部分基因RT－PCR产物电泳结果

2.2 MyD88测序及分析 阳性质粒测序后得到195bp的pMyD88基因序列：

GTTGGAGCAAACGGAGTTCAAGCTGAAGCTCT GTGTCTTTGACCGGGACGTCTTGCCAGGAACG TGCGTGTGGTCCATCAGCGGAGAGCTTATAGA AAGGAGGTGTCGGAGGATGGTGGTCGTCATTT CAGACGATTACCTGGAAAGCGACGAATGCGAC TTTCAGACCAAATTTGCTCTTAGTCTTTCCCCA GG

在GenBank数据库进行BLAST初步比较分析发现，pMyD88基因序列与G.gallus（NM＿001030962.1）、M.gallopavo（XM＿003206927.1）、T.guttata（XM＿002196725.1）、R.norvegicus（NM＿198130.1）、H.sapiens（NM＿001172568.1）的相似性分别为92%、92%、89%、78%、76%。

2.3 MyD88氨基酸同源性及系统进化树分析 由pMyD88基因序列推导的氨基酸序列经BLAST分析，该cDNA部分基因位于编码MyD88分子TIR结构域内，与GenBank登录的其他物种相应MyD88TIR域氨基酸序列作同源性比对结果表明（图2），鸭 MyD88与鸡、火鸡、珍珠鸟的同源性最高，为97%～100%；与人、鼠、牛、猪、狗、马、兔、鲤鱼的同源性为83%～84%；与绵羊的同源性为 79%。

图2 pMyD88推导氨基酸序列与其他物种间的同源性比较

DNAStar软件进行系统进化树分析（图3），结果表明：鸭 MyD88与鸡的亲缘关系最接近，与火鸡、珍珠鸟的较为接近，与狗、鼠、兔、人、猪、马、绵羊、牛的亲缘关系依次渐远，与鲤鱼的亲缘关系最远；其中鸭与鸡、火鸡在分化年限上最接近，说明他们的MyD88有密切关系。

图3 pMyD88推导氨基酸序列与其他物种间的系统进化树

2.4 MyD88在鸭组织中分布 RT－PCR结果显示，以持家基因GAPDH为参照，MyD88基因在鸭心脏、肝脏、脾脏、肺脏、腔上囊中均有表达，且表达量存在差异，在肾脏、脑中未见转录产物（图4）。

图4 鸭MyD88mRNA在组织中的转录情况

3 讨论

MyD88属于Toll／IL－lR家族和死亡结构域家族成员，MyD88的TIR结构域与TLRs和IL－1Rs的TIR相结合从而介导下游信号传导，最终诱导炎症细胞因子如IL－1、IL－6、IL－8、IL－12、TNF－α、干扰素和粘附因子等基因的表达，而通过抑制MyD88来减少细胞因子的表达能抑制疾病的发展［7］。MyD88分子在进化过程中具有较高的保守性，在各物种间TIR结果域的同源性明显高于死亡结构域。李强等［8］克隆出猪MyD88完整的CDS序列，与人、牛、小鼠和褐鼠的MyD88分子对比后同源性在78.2%～88.4% 之间。Yafeng Qiu等［9］得出鸡MyD88氨基酸序列与人、鼠MyD88同源性在70%左右。现还未见有关于鸭MyD88的研究，本试验克隆出鸭MyD88部分cDNA序列，氨基酸序列比对结果表明，鸭MyD88TIR结构域与禽鸟类同源性较高，在进化中有较高的保守性。

早期的研究认为，MyD88仅在骨髓组织中表达［1］，但后来研究证明，MyD88可在哺乳动物的非骨髓组织中表达，且不同组织表达水平存在一定的差异，而且与动物年龄也有一定的关系［10］。以热灭活嗜水气单胞菌刺激中华鳖后48h内，肝、脾和肾组织中MyD88mRNA相对表达量均出现不同程度的增加［11］。本试验检测到鸭的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、腔上囊均有MyD88mRNA转录，在肾脏、脑中未检测到，且不同组织中MyD88的表达丰度存在差异，表明MyD88分布于鸭的周围免疫器官、消化器官、呼吸器官、循环器官。提示MyD88在不同种属动物及不同组织部位具有生物多样性。

［1］Lord K A，Hoffman－Liebermann B，Liebermann D A.Nucleotide sequence and expression of a cDNA encoding MyD88，a novel myeloid differentiation primary response gene induced by IL－6［J］.Oncogene，1990，5（7）：1095－1097.

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［4］李跃华，哈团柱，陈琪，等.MyD88依赖性核因子－κB信号途径在心肌肥大发生过程中的调控作用［J］.中华医学杂志，2005，85（4）：267－272.

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［9］Yafeng Qiu，Yang Shen，Xiangdong Li，etal.Molecular cloning and functional characterization of a novel isoform of chicken myeloid differentiation factor 88（MyD88）［J］.Developmental and Comparative Immunology，2008（32）：1522－1530.

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