双酶分步水解法制备棉籽多肽的蛋白酶筛选

林 虬 黄 薇 宋永康 姚清华 苏德森

双酶分步水解法制备棉籽多肽的蛋白酶筛选

林 虬 黄 薇 宋永康 姚清华 苏德森

(福建省精密仪器农业测试重点实验室福建省农业科学院中心实验室，福州 350003)

本研究利用6种蛋白酶对棉籽蛋白进行单酶和双酶组合水解，测定水解过程中棉籽蛋白的水解度，同时对酶解产物的多肽得率进行了分析比较。结果表明，为了高效制备棉籽多肽，可先用Alacalase水解蛋白酶对棉籽蛋白进行水解，再利用Flavourzyme风味蛋白酶继续酶解，最终产物的水解度可达到36．58%，多肽得率达到71．32%，相比单独应用Alcalase水解蛋白酶，水解度提高了91．32%，多肽得率提高5．88%。

棉籽蛋白 双酶分步酶解 水解度 多肽得率

我国是世界上主要产棉大国，2010/11年度我国棉籽产量预计将达到1224万吨(国家粮油信息中心2010年9月份报告)，提油后的棉籽粕粗蛋白含量为38%～50%，必需氨基酸含量除蛋氨酸稍低外其余均达到联合国粮农组织和世界卫生组织(FAO/WHO)推荐标准，是一种理想的植物蛋白质资源［1］。但长期以来，棉籽粕因含有棉酚等有毒有害物质而使其用途受到局限，未能得到很好的开发利用，造成了蛋白质资源的极大浪费。随着棉酚提取工艺和棉籽去毒工艺的日趋完善，棉籽蛋白资源受到了食品工业和饲料工业的广泛关注，如何进一步开发利用棉籽蛋白资源成为当前研究的热点。

利用生物催化技术将低值的蛋白源转化成多肽、寡肽等高值蛋白原料是目前棉籽蛋白质开发利用的新途径。棉籽蛋白经蛋白酶水解后，分子量减少，结构松弛，更利于人和动物体消化吸收，其中的一些多肽片断还具有独特的生理功能，如降血压、促进生长、抗氧化、增强免疫力等［2］。最近的研究表明［3－4］，单一蛋白酶水解很难在短时间内获得高水解度、高得率的棉籽多肽，而采用双酶分步酶解可以显著提高水解度和多肽得率。因此，选择合适的工具蛋白酶对棉籽蛋白进行分步酶解是实现在较短时间内获得高水解度高多肽得率棉籽肽的有效途径之一。本研究选取6种商品化蛋白酶进行了水解试验，并对这些酶进行适当的组合，筛选出获得高水解度高多肽得率的棉籽肽加工用蛋白酶。

1 材料与方法

1．1 材料与试剂

脱酚棉籽蛋白:新疆震企油脂有限公司;Alcalase水解蛋白酶:内切肽酶，诺维信公司;Protamex复合蛋白酶:内切酶，诺维信公司;Flavourzyme风味蛋白酶:内切酶和外切酶两种活性，诺维信公司;Protex．7L细菌中性蛋白酶:金属中性肽链内切酶，杰能科公司;胰蛋白酶:内切酶，Aeresco公司;木瓜蛋白酶，内切酶，福州福科公司。对苯二甲醛(OPA):国药集团化学试剂有限公司;十二烷基磺酸钠(SDS)、二硫苏糖醇(DTT):Biosharp公司;甲醛、茚三酮、氢氧化钠、盐酸等其他试剂均为分析纯。

1．2 主要设备

Kjeltec2300自动凯氏定氮仪:瑞典Foss公司;L－8800氨基酸自动分析仪:日本HITICHI公司;U－3900紫外分光光度计:日本Hitachi公司;AL－204电子分析天平:瑞士METTLER TOLEDO公司。

1．3 分析方法

1．3．1 蛋白酶酶活力测定

蛋白酶的酶活力测定方法采用Folin－酚法［5］。酶活力的定义为:1 g或1 mL酶制剂在酶反应的最适温度，最适pH的条件下水解棉籽蛋白，1 min产生1μg酪氨酸为1个酶活力单位。

1．3．2 水解度的测定

水解度(DH，Degree of Hydrolysis)的定义是指蛋白质水解过程中，被断裂的肽键数h(mmol/g蛋白质)与给定蛋白质的总肽键数htot(mmol/g蛋白质)之比。水解度的测定方法采用邻苯二甲醛(OPA)法［6］，其计算公式为:DH=h/htot×100%。

1．3．3 棉籽蛋白总肽键数htot的测定

棉籽蛋白的htot可以由组成棉籽蛋白的氨基酸含量组成计算出［7－8］。氨基酸含量组成测定按GB/T 5009．124—2003进行。

1．3．4 多肽得率的测定

对特定底物而言，三氯乙酸可以定性地反映蛋白质的分解情况，溶解指数越高，表明较短肽链的含量也越高［9］。因此，多肽得率采用三氯乙酸可溶性氮法(TCA－SNI)［10］进行检测，其计算公式为:TCA－NSI=N1/N0×100%，式中:TCA－NSI表示三氯乙酸可溶性氮得率/%;N1表示在10%TCA中可溶性氮量;N0表示原料中总氮量。

1．4 试验方法

1．4．1 棉籽蛋白酶解前处理

由于棉籽蛋白的溶解性较差，对棉籽蛋白进行前处理可以显著提高水解效果［11］。水解前先对棉籽蛋白进行粉碎，过筛(过筛粒度控制在60目左右)，然后称取粉碎棉籽蛋白10．0 g，置于反应杯中，按1∶10(g/mL)固液比加入蒸馏水，用1．0%氢氧化钠调pH至8，40℃浸提2 h，作为酶反应的底物溶液。

1．4．2 单酶水解试验

取经过前处理的棉籽蛋白溶液，用氢氧化钠或者盐酸调节体系pH至酶的最适pH值，加入一定量的蛋白酶，在酶的最适温度下进行酶解反应，分别在酶解 0、20、40、60、90、120、150、180 min 时取样，取出的样品溶液置85℃水浴锅中灭酶10 min，5000 r/min离心20 min，所得上清液即为棉籽蛋白水解产物，保存在4℃待分析用。不同蛋白酶的用量和反应条件见表1。

表1 不同蛋白酶的用量和反应条件

1．4．3 双酶组合分步水解试验

根据单酶水解试验结果，选取一种蛋白酶作为制备棉籽多肽的主要水解酶，再将主要水解酶与其他5种蛋白酶进行组合，其中蛋白酶的组合包括改变两种酶的作用顺序。水解步骤为在一定条件下向棉籽蛋白底物溶液中加入组合中的第1种工具酶，水解150 min后，灭酶，调温度、pH再加入第2种工具酶继续水解150 min。各蛋白酶的酶解条件按表1进行。

2 结果与分析

2．1 脱酚棉籽蛋白的总肽建数htot

依据GB/T 5009．124—2003，测得受试棉籽蛋白18种氨基酸的含量，结果见表2。从表2可知，脱酚棉籽蛋白的蛋白含量为48．00%，总肽键数 htot=359．00 mmol/48．00 g=7．48 mmol/g。

表2 市售棉籽蛋白中的各种氨基酸含量

2．2 蛋白酶酶活力测定结果

利用Folin－酚法，对Alcalase水解蛋白酶、Protamex复合蛋白酶、Flavourzyme风味蛋白酶、Protex．7L细菌中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等6种蛋白酶的酶活力进行测定，测定结果见表3。测得的结果将为水解试验中蛋白酶的添加量提供可靠依据。

表3 不同蛋白酶酶活力测定结果

2．3 单酶水解试验

工具蛋白酶的选择对于棉籽蛋白资源酶解利用非常重要。不同蛋白酶由于酶切作用方式及酶切位点不同，其对棉籽蛋白的水解速率、水解度以及多肽得率都有很大的差异。为了选择合适的棉籽蛋白水解酶，本试验选取了6种分别来源于微生物、植物和动物中较有代表性的蛋白酶，以水解度和多肽得率作为指标，观测各酶对棉籽蛋白的水解情况。

2．3．1 各酶水解过程中水解度的动态分析

图1为不同蛋白酶水解棉籽蛋白过程中水解度的变化曲线。从图1可以看出，在较为适宜的条件下，6种蛋白酶水解棉籽蛋白到达150 min后，反应趋于缓慢，水解度基本不再增加。考虑到酶促反应的特点，在实际应用中，整个水解过程可控制在150 min内。在同等酶活力条件下，不同蛋白酶的水解棉籽蛋白的能力还是有显著差异的。Alcalase水解蛋白酶的水解能力超过其它蛋白酶，最后水解度可达到19．1%，其次是Flavourzyme风味蛋白酶(15．5%)＞木瓜蛋白酶(15．1%)＞Protex．7L细菌中性蛋白酶(14．5%)＞Protamex复合蛋白酶(13．5%)＞胰蛋白酶(11．6%)。

图1 不同蛋白酶水解过程中水解度变化情况

2．3．2 酶解产物的多肽得率分析

对不同蛋白酶水解棉籽蛋白所得产物的多肽得率进行分析，结果见表4。从表4可以看出，Alcalase水解蛋白酶的酶解产物的多肽得率最高(67．4%)，其次是胰蛋白酶(63．1%)Protamex复合蛋白酶(62．4%)＞木瓜蛋白酶(61．5%)＞Flavourzyme风味蛋白酶(51．6%)＞Protex．7L细菌中性蛋白酶(45．1%)。试验数据进行差异显著性检验表明，Alcalase水解蛋白酶的酶解产物的多肽得率与其他蛋白酶酶解产物相比差异达到极显著水平。

表4 不同蛋白酶酶解产物的多肽得率

综上，在适宜的条件下Alcalase水解蛋白酶对棉籽蛋白的水解能力相比其他几种蛋白酶最强，同时水解产物中的多肽含量也显著高于其他水解产物。因此，在实际应用中，可选择Alcalase水解蛋白酶作为主要水解蛋白酶。

2．4 双酶组合水解试验

为了获得高水解度高多肽得率的棉籽肽，将Alcalase水解蛋白酶与其他5种蛋白酶进行组合实行分步酶解，同样以水解度和多肽得率作为指标，观测各组合酶对棉籽蛋白的水解情况。

2．4．1 双酶分步水解过程中水解度的动态分析

由双酶组合分步水解的结果(图2)可以看出，Alcalase水解蛋白酶与Protamex复合蛋白酶、Protex．7L细菌中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶组合的试验结果相似。第1步酶解使用Alcalase水解蛋白酶，第2步采用另一种蛋白酶，所得水解度变化平缓，与A1calase水解蛋白酶单独作用相比变化不大。改变两种酶的作用顺序，在终止第1步蛋白酶的反应之后，Alcalase水解蛋白酶的加入能够使水解度继续增加，但最终达到的水解度与前一种水解顺序的结果相似。由单酶水解的结果可知(图1)，Alcalase水解蛋白酶的作用效率比较高，短时间内达到较高的水解度，致使其他内切酶活性的蛋白酶作用位点被水解或遭到了一定程度的破坏［12］。因此，使用Alcalase水解蛋白酶进行反应后，加入第2种蛋白酶进行反应，水解度不会发生较大的变化。

由Alcalase水解蛋白酶与Flavourzyme风味酶组合反应的试验结果来看，两种顺序都能够使水解度得到较大的提高。先用Alcalase水解蛋白酶，然后再加入Flavourzyme风味酶的作用效率要高一些，达到的水解度(36．6%)比另一种反应顺序的水解度(29．1%)要高。这说明Alcalase水解蛋白酶的反应过程对Flavourzyme风味酶的作用位点的影响相对其他蛋白酶要小一些。分析原因可能与Flavourzyme风味酶具有外切酶活性有关。

图2 双酶分步水解过程中水解度变化情况

2．4．2 双酶分步水解产物的多肽得率分析

对双酶组合分步水解体系所得棉籽蛋白水解产物的多肽得率进行分析，结果见图3。从图3中可知，先用Alcalase水解蛋白酶水解再加入Flavourzyme风味酶继续水解所得产物的多肽得率最高，可达71．3%;其次为 70．9%、70．8% 等;最低为 63．3%。但差异显著性检验表明，产物的多肽得率不存在显著差异。说明使用双酶分步水解法，棉籽蛋白水解较为完全，能够获得高短肽得率的水解产物。

图3 双酶分步水解法棉籽蛋白酶解产物的多肽得率

3 讨论与结论

利用Alcalase水解蛋白酶、Protamex复合蛋白酶、Flavourzyme风味蛋白酶、Protex．7L细菌中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶各单酶体系对棉籽蛋白进行酶解试验，结果显示各蛋白酶在水解150 min之后水解度趋于平缓，其中Alacalase水解蛋白酶与其他蛋白酶相比，反应迅速、水解能力(19．1%)最强，短肽得率(67．4%)最大。在实际应用中，可选择作为棉籽蛋白主要水解蛋白酶。

进一步探讨双酶分步水解法酶解棉籽蛋白。研究结果显示，双酶分步水解棉籽蛋白的效果要优于单酶体系，水解度和多肽得率均有较大的提高。在水解过程中，酶的加入顺序对水解度的变化有一定的影响。最佳的双酶组合水解方法为:先用Alcalase水解蛋白酶水解150 min，之后再加入Flavourzyme风味酶继续水解150 min，所得产物的水解度达到36．6%、多肽得率达到71．3%。相比单独应用Alcalase水解蛋白酶，水解度提高了91．3%，多肽得率提高5．9%。刘军等［13］的研究表明，当棉籽蛋白经酶水解后其疏水性氨基酸残基苦味暴露出来，使得到的棉籽多肽带有明显的苦味，Flavourzyme风味酶能够将位于肽链末端的疏水性氨基酸残基切下，有效减小棉籽多肽的苦味。综合水解能力表现，实际生产棉籽多肽用Alcalase碱性蛋白酶与Flavourzyme风味酶进行分步水解效果较好。

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Selection of Proteolytic Enzymes to Prepare Cottonseed Peptides by Two－Step－Hydrolysis

Lin Qiu Huang Wei Song Yongkang Yao Qinghua Su Desen
(Fujian Key Laboratory of Precise Measurement of Agricultural Central Laboratory，Fujian Academy of Agricultural Sciences，Fuzhou 350003)

6 proteases are used to single and double hydrolyze the cottonseed protein and determine hydrolysis degree of cottonseed protein，as well as analyze and compare the rate of peptides production．The results indicated that the optimal reaction systems were as follows:firstly，Alacalase hydrolysis，then Flavourzyme hydrolysis．Under the optimal system，the degree of hydrolysis 36．58%，cottonseed peptides with the yield of 71．32%were prepared．Hydrolysis degree of protein was increased to 36．5%and the rate of peptides production was 5．88%higher than that of the hydrolysis of cottonseed protein with only Alcalase．

cottonseed protein，two － step － hydrolysis，hydrolysis degree of protein，the rate of peptides production

Q814

A

1003－0174(2012)02－0076－06

福建省公益类科研院所基本科研专项(2010R1027－1)，福建省科技重大专项(2010NZ0002)，福建省农科院青年人才创新基金(2010QC－17)

2011－05－19

林虬，男，1963年出生，副研究员，水产生物饲料学