多重/泛耐药鲍曼不动杆菌分子流行病学及整合子研究Δ

李鑫，郭雷静，陆思静（辽宁医学院附属第一医院，辽宁锦州121000）

多重/泛耐药鲍曼不动杆菌（MDR-Ab/PDR-Ab）的出现，给医院感染控制及临床治疗带来了极大的困难，被称为21世纪革兰阴性菌中的“耐甲氧西林金黄色葡萄球菌”。其6个主要流行克隆株在我国广泛流行，分布于北京、上海、重庆、沈阳及浙江省的多个城市[1]。整合子被认为是耐药基因在水平传播的重要因子。本研究目的在于了解我院MDR-Ab/PDR-Ab的分子流行病学及整合子是否介导了耐药基因的传播。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

我院微生物科2010年各类临床标本中培养并通过MicroScan WalkAway-40全自动微生物鉴定系统及其配套的鉴定药敏复合板鉴定为MDR-Ab/PDR-Ab的38株作为本研究重点，同一患者同一部位只统计初次分离株。

1.2 仪器与试剂

MicroScan WalkAway-40全自动微生物鉴定系统及其配套的鉴定药敏复合板由美国Dade公司生产；引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成；Taq DNA聚合酶、10×PCR缓冲液、DNA Marker、dNTPs、内切酶HinfⅠ和AVaⅡ、琼脂糖及凝胶回收试剂盒均购自宝生物工程（大连）有限公司（大连TaKa-Ra公司）；细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；DNA Thermal Cycler 2400为美国Perkin-Elmer公司产品。

1.3 肠杆菌科基因间重复一致序列（ERIC-PCR）DNA检测模板的制备

从LB培养基上挑取单个受试菌落加入5 mL LB培养基中，37 ℃、200 r·min－1震荡孵育16～20 h，取上述培养菌液2 mL，采用离心柱型细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌DNA作为模板。

1.4 ERIC-PCR

引物序列：ERIC1：5′-ATG TAA GCT CCT GGG GAT TCA C-3′；ERIC2：5′-AAG TAA GTG ACT GGG GTG AGC G-3′。采用25 μL反应体系：模板2 μL、2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL、ERIC引物各0.5 μL（25 μmol）、加无菌蒸馏水至总体积25 μL。置聚合酶链式反应（PCR）仪中反应，程序为：94℃预变性5 min；然后94℃变性30 s，48℃退火1 min，72℃延伸4 min，进行35个循环；最后72℃延伸6 min。用2%琼脂糖凝胶电泳，PCR产物在1×TBE电泳缓冲液中电泳，溴化乙锭染色，用紫外灯下观察扩增产物，收集图像。

1.5 整合酶基因检测模板制备

使用煮沸法获取DNA模板：直接挑取3～4个菌落于200 μL无菌水中，旋涡振荡30 s，充分混匀后置沸水浴中恒温保持10 min后取出，迅速置冰浴中放置10 min；12000 r·min－1离心5 min，取上清2 μL即为DNA模板。

1.6 整合酶基因的检测

引物序列：IntIF 5′-TGC GGG TYA ARG ATB TKA ATT-3′；IntIB 5′-CAR CAC ATG GGT RTA RAT-3′，预扩增片段长度为491 bp。采用25 μL PCR反应体系如下：10×PCR缓冲液5 μL，dNTPs 0.5 μL，上、下游引物（20 μmol·L－1）各0.5 μL，0.125 μLTaq DNA聚合酶5 U·μL－1（TaKaRa公司），加灭菌蒸馏水至总体积25 μL，操作在冰浴中完成。置PCR仪中反应，程序为：94℃预变性5 min；然后按94℃变性1 min，51℃退火30 s，72℃延伸45 s，进行30个循环；最后72℃延伸10 min，4℃保护。用1.0%的琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，在紫外灯下观察扩增产物，出现明显亮带的为初筛阳性，收集图像。阳性条带行切胶纯化后分别用内切酶（HinfⅠ、AVaⅡ）行限制性片段长度多态性分析，同时选取酶切片段长度一致的PCR纯化产物测序，用BLAST程序分析。

2 结果

2.1 MDR-Ab/PDR-Ab科室及标本分布

38株MDR-Ab/PDR-Ab在ICU检出率最高，21株，占55.3%；其次为呼吸科7株、神经外科4株、骨创伤科2株、烧伤科2株、内分泌科1株、血液科1株，分别占18.4%、10.5%、5.3%、5.3%、2.6%、2.6%。标本以下呼吸道和手术切口分离最高，分别占68.4%（26/38）%和15.8%（6/38）。

2.2 ERIC-PCR结果

ERIC-PCR产物多呈3～5条带，主带为2～3条，从250～1500 bp不等。38株MDR-Ab/PDR-Ab由7种基因型组成，其中 1～23为A型，占60.5%（23/38），分别来自ICU 13株，占56.5%（13/23）；呼吸科4株，占17.4%（4/23）；骨科2株，占8.7%（2/23）；血液科1株，内分泌科1株，神经内科1株，神经外科1株。37为A型的一个亚型，来自ICU。24～26为B型，24来自神经外科，25、26来自ICU。27为B型的一个亚型B1型，来自于ICU科。29、33、38为C型，29、33来自呼吸科，38来自ICU。28、36为D型，分别来自神经外科和呼吸科。30～32为E型，分别来自呼吸科、高级服务中心、ICU。34、35分别为F、G型，都来自于ICU。D、F、G型菌株的基因型无密切相关性。代表菌株ERIC-PCR结果如图1。

图1 ERIC-PCR结果图Fig 1 ERIC-PCR results figure

2.3 整合酶基因检测结果

38株MDR-Ab/PDR-Ab共检出含整合酶基因菌株28株，经内切酶HinfⅠ、AVaⅡ酶切后证实为Ⅰ类整合子，经基因测序比对分析进一步证实为Ⅰ类整合子，检出率为73.7%（28/38）。A型菌株整合酶基因阳性者17株，占整合酶基因阳性菌株的60.7%（17/28）。来自ICU菌株整合酶阳性菌株为17株，占ICU检出菌株总数的的81.0%（17/21），代表结果如图2。

图2 整合酶基因检测及酶切图Fig 2 Gene detection of integrase and cleavage map

3 讨论

近年来，鲍曼不动杆菌引起的感染呈增高趋势，特别是多重耐药（指对3种以上结构、作用机制不同的抗菌药物耐药）和泛耐药（指对除粘菌素外的所有临床上可获得抗生素均耐药）引起的感染，在临床上几乎无药可选择[2]，已成为严重的公共卫生问题。我们所研究的这些菌株仅呼吸道标本就占67.5%。因此，在对感染性疾病的管理中应加强对呼吸道感染的控制和预防，防止交叉感染及暴发流行。标本分布主要以ICU为主，分离率为55.3%。研究也发现[3]，患有严重基础疾病、免疫功能低下、住院时间较长、接受侵入性操作、长期应用抗菌药物、应用免疫抑制剂或糖皮质激素等因素均是危重患者发生多重耐药鲍曼不动杆菌医院感染的易感因素。

近年来，基因盒-整合子学说的提出为多药耐药性的研究开拓了新领域。整合子是一种新的可移动基因元件，其两端是高度保守序列，分别称作5′保守端、3′保守端；5′和3′端之间为可变区，是基因水平传递系统。根据整合子5′保守区整合酶基因的同源性差异，整合子被分为4类：Ⅰ类、Ⅱ类、Ⅲ类和Ⅳ类，其中前3类常与耐药相关，又被统称为耐药整合子（RI），这些整合子可捕获和整合细菌的外源性耐药基因，造成多种耐药基因在不同菌株甚至不同菌种间的水平转移，因而与宿主菌的多药耐药性的发生、发展密切相关。经过对38株MDR-Ab/PDR-Ab菌株进行同源性分析发现，38株菌株分别来自7组不同分型的克隆株，整合酶基因的检出率为60.7%（17/28）。A型克隆株是ICU的主要类型，A型克隆菌株中整合酶阳性菌株分布在ICU 11株、呼吸科3株、神经外科1株和骨科2株。检出的2株骨科菌株的患者曾在ICU住院治疗，说明科室间存在交叉感染的可能性，这种克隆传播也可能是导致耐药菌株不断增加的重要原因之一。来自ICU的菌株Ⅰ类整合酶基因阳性菌株占81.0%（17/21），低于我国台湾地区的85.0%检出率[4]，从时间分布上看，这些菌株在全年均有分布。综上，整合子在同一克隆株甚至在同一科室之内及不同科室之间传播起到非常关键的作用，因此加强多药耐药菌的管理是非常必要的。

依据我们ERIC-PCR及整合酶基因检测结果，结合国内、外研究[5～7]，我们不难发现，在不同地区的医院内，多个相同克隆株在不同科室及个体间的相互传播可能是医院内鲍曼不动杆菌感染原因之一。因此，重视医护人员手卫生、加强消毒隔离措施、合理应用抗生素是控制医院MDR-Ab／PDR-Ab感染的重要手段。

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