瓦尼木层孔菌菌丝体多糖提取工艺的研究

巴媛媛，朴美子，孟菡妍

（青岛农业大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266109）

瓦尼木层孔菌菌丝体多糖提取工艺的研究

巴媛媛，朴美子*，孟菡妍

（青岛农业大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266109）

为优化瓦尼木层孔菌菌丝体多糖提取工艺，在单因素试验的基础上，以提取温度、提取时间、水料比3个因素为自变量，以瓦尼木层孔菌菌丝体多糖提取率为响应值，使用BOX-Benhnken中心组合试验和响应面分析法，优化瓦尼木层孔菌菌丝体多糖提取工艺，并确定瓦尼木层孔菌菌丝体多糖的最佳工艺条件为：提取温度80.99℃、提取时间2.13 h、水料比32.06∶1（mL/g）。在此条件下，实际提取率为10.49%，与预测值基本吻合。

瓦尼木层孔菌；多糖；提取工艺；响应面分析

瓦尼木层孔菌（Phellinus vaninii Ljub），又名杨黄，隶属担子菌纲、非褶菌目、锈革孔菌科、木层孔菌属[1]。瓦尼木层孔菌以生长在天然林中老龄的杨树上，且子实体孔口表面呈黄色、菌盖边缘为黄色带状环纹而得名[2]，人工林中很难找到。该菌具有抑制肿瘤、解毒、补肾、增强人体免疫力、防治癌症等功效。近几年，对瓦尼木层孔菌的驯化栽培已经获得成功[3-5]，但是关于瓦尼木层孔菌活性物质提取的研究相对较少，尤其没有与其多糖相关的报道。

本试验主要利用瓦尼木层孔菌液体发酵所得的菌丝体为原料，采用热水浸提法提取菌丝体多糖[6-7]，用苯酚-硫酸法[8]测定多糖含量，以菌丝体粗多糖提取率为指标，在单因素试验基础上，利用响应面分析法[9-10]对瓦尼木层孔菌菌丝体多糖提取工艺条件进行优化，为新型真菌多糖产品的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

瓦尼木层孔菌：青岛农业大学中韩食品生物技术研究所。

葡萄糖、无水乙醇、乙醚、丙酮、浓硫酸、苯酚等（均为分析纯）。

1.2 仪器与设备

IS-RDH1恒温振荡器：美国精骐有限公司；SWCJ-1F超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；BCD-216YH海尔冰箱：海尔集团；DU-800紫外分光光度计：美国Beckman公司；分析天平：奥豪斯公司；TGL-16C台式离心机：上海安亭科学仪器厂；YXQ-LS-SII立式压力蒸汽灭菌器：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；DHG-9246A电热恒温鼓风干燥箱：上海精弘试验设备有限公司；RE-52B旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；一列二孔电热恒温水浴锅：龙口市先科仪器公司。

1.3 试验方法

1.3.1 工艺流程

准确称取一定质量的瓦尼木层孔菌菌丝体干粉→脱脂→热水浸提→离心→上清液→脱蛋白→浓缩→醇沉→离心→沉淀→依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤→60℃烘干→瓦尼木层孔菌菌丝体粗多糖

1.3.2 瓦尼木层孔菌菌丝体多糖含量的测定

用葡萄糖标准品通过苯酚-硫酸法制备标准曲线，得回归方程A=0.0181C+0.0006[C为葡萄糖质量浓度，（μg/mL），A为吸光度]，R2=0.9999，线性范围0～54μg/mL。同样测定样品提取液中多糖的吸光度，通过回归方程计算瓦尼木层孔菌菌丝体多糖的含量。

1.3.3 多糖提取率的计算

1.3.4 瓦尼木层孔菌菌丝体多糖水提工艺的优化

试验选用提取温度、提取时间和水料比对多糖提取率起主要影响的3个因素，以瓦尼木层孔菌菌丝体多糖提取率为指标，进行单因素考察。在单因素试验结果基础上，根据Box-Behnken中心组合设计原理，设计三因素三水平的响应面试验设计，因素见表1。

表 1 响应面分析因素与水平Table 1 Variables and levels in responses surface design

试验共有15个试验点，其中12个为分析因子，3个为零点。零点试验3次，以估计误差。数据用Design expert7.0程序进行分析，并由此得出响应面分析图和方差分析表。进而得出模型方程，通过对模型方程的分析，得出最佳的菌丝体多糖提取工艺条件。

2 结果与讨论

2.1 提取温度对瓦尼木层孔菌菌丝体多糖提取率的影响

固定水料比20∶1（mL/g），提取时间2 h，提取次数3次，以瓦尼木层孔菌菌丝体多糖的提取率为指标，考察不同的提取温度对多糖提取率的影响，结果见图1。

由图1可知，在提取温度小于80℃时，瓦尼木层孔菌菌丝体多糖提取率随温度的升高而升高；当温度大于80℃以后，多糖提取率随温度的升高而降低，这可能是由于高温条件下多糖结构遭到破坏的结果。因此，选择提取温度在80℃左右。

2.2 提取时间对瓦尼木层孔菌菌丝体多糖提取率的影响

固定水料比20∶1（mL/g），提取温度80 ℃，提取次数3次，以瓦尼木层孔菌菌丝体多糖的提取率为指标，考察不同的提取时间对多糖提取率的影响，结果见图2。由图2可知，多糖提取率随着提取时间的延长，呈现先上升再下降的总体趋势，但超过2 h时多糖提取率虽然有所增加但不明显。并且提取时间过长，部分多糖分解从而造成损失，因此，选择提取时间在2 h左右。

2.3 水料比对瓦尼木层孔菌菌丝体多糖提取率的影响固定提取温度80℃，提取时间2 h，提取次数3次，

以瓦尼木层孔菌菌丝体多糖的提取率为指标，考察不同的水料比对多糖提取率的影响，结果见图3。

由图3可知，当提取水料比为10∶1～30∶1（mL/g）时，随着料水比增加其瓦尼木层孔菌菌丝体多糖提取率逐渐增大，当水料比大于30∶1（mL/g）时多糖提取率有逐渐下降，因此，选择水料比在30∶1（mL/g）左右。

2.4 瓦尼木层孔菌菌丝体多糖提取工艺的响应面优化为了拟合多元二次模型方程各项系数的最优值，

根据Box-Behnken试验设计要求，对影响多糖提取率的关键因素进行15组试验，其中12组为分析因子，3组为零点。零点试验3次，以估计误差，其结果见表2。

表 2 响应面分析方案及结果Table 2 Process variables and levels in response surface design arrangement and experimental response values

通过对该数据进行二次多项拟合，获得多糖提取率对提取温度、提取时间和水料比的多元回归方程：

表 3 方差分析表Table 3 Variance analysis for yield of polysaccharises with various extraction conditions

由表3可知，试验所选用的模型高度显著，拟合度好，预测值与实际值之间具有高度的相关性（R2=0.9871）。

由表4的Prob>F值可以看出，在所选的各因素水平范围内，对结果的影响排序为：水料比>提取温度>提取时间。且模型的复相关系数R2为98.71%，说明模型拟合程度良好，试验误差小，该模型是合适的。因此可以用该模型方程来分析和预测不同条件下瓦尼木层孔菌菌丝体多糖提取率的变化。

图4～图6反映了各因素对响应值的影响，由等值线图可以看出存在极值的条件应该在圆心处。比较3组图可知，三因素对瓦尼木层孔菌菌丝体多糖提取率都有显著的影响，水料比（X3）的影响为最显著，表现为等高线更为陡峭；提取温度（X1）和提取时间（X2）次之，表现为等到线曲线较平滑，说明两者对响应值影响较小。

表 4 回归分析结果Table 4 Analysis of variance for quadric regression model

2.5 回归模型的验证

通过上述多元回归方程优化得出Box-Behnken实验的编码值分别为X1=0.1976，X2=0.2526，X3=0.4130，所对应的瓦尼木层孔菌菌丝体多糖理论最佳提取条件为提取温度80.99℃、提取时间2.13 h、水料比32.06∶1（mL/g）时，其提取率最高可达10.51%。根据此条件，进行实验室重复验证试验，测得其抑制率最高可达10.49%，与理论值较为接近。结果证明，该模型准确，适用于瓦尼木层孔菌菌丝体多糖提取工艺的优化。

3 结论

本文在单因素试验基础上，运用响应面法优化了瓦尼木层孔菌菌丝体多糖的提取条件，最终得出菌丝体多糖最佳理论提取条件为提取温度80.99℃、提取时间2.13 h、提取水料比32.06∶1（mL/g）。在此条件下，其瓦尼木层孔菌菌丝体多糖提取率最高可达10.49%。与理论值10.51%较为接近。

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Study on Extraction Technology of Polysaccharides from Phellinus vaninii Ljub

BA Yuan－yuan，PIAO Mei－zi*，MENG Han-yan
（College of Food Science and Engineering，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，Shandong，China）

In this study，optimum condition of extraction of polysaccharides from Phellinus vaninii Ljub was optimized by response surface test.On the basis of single－factor test，the mathematical regression model was established on the dependent variable（extraction yield of polysaccharides from Phellinus vaninii Ljub）and independent variables （extract temperature，extract time，water/material ratio）by Box－Benhnken center composite design and response surface methodology.The optimum extraction conditions were as follows：extract temperature 80.99 ℃，extract time 2.13 h，water/material ratio 32.06∶1 （mL/g）.Under these conditions，the yield of polysaccharides from Phellinus vaninii Ljub was 10.49%，consistent with the prediction value.

Phellinus vaninii Ljub；polysaccharides；extraction technology；response surface analysis

巴媛媛（1984—），女（汉），硕士，研究方向：农产品加工与贮藏。

*通信作者：朴美子（1966—），女（朝鲜），副教授，理学博士，研究方向：功能食品的开发。

2011-06-24