大黄素对白血病K562细胞抑制增殖和诱导凋亡体外研究近况

孟 晋

天津中医药大学第一附属医院 300193

白血病（leukemia）是一类造血干细胞的恶性克隆性疾病，是最常见的血液系统恶性疾病。我国白血病的发病率约为2.76/10万，且近年有上升的趋势。在恶性肿瘤所致的死亡率中，白血病居第6位（男性）和第8位（女性），但在儿童和35岁成人中则居第1位。随着新的化疗药物的出现和造血干细胞移植技术的不断提高，白血病患者的治疗疗效和生存率有了很大的提高。但是仍有30%左右的患者经过治疗后不能缓解或者缓解后再复发。造成治疗失败的主要原因是治疗过程中出现原发或继发耐药（drug resistance），特别是多药耐药（multidrug resistance，MDR），导致化疗失败。因此积极寻找新的有效、低毒的化疗药物和化疗方案已经成为血液学工作者的重要任务之一。大黄（Rhubarb）为中医临床常用中药，具有泻下攻积、凉血解毒、清热利湿等作用。现代药理研究及临床应用表明，大黄具有良好的抗病毒、止血、健胃、利胆、泻下、解热、镇痛、抗炎、利尿、降脂、降压、抗肿瘤及改善肾功能等多种作用。其有效成分之一的大黄素（Emodin，EM）是一种蒽醌类化合物，具有广泛的作用，如抗肿瘤、抗菌、抗老化及促进胃肠平滑肌运动［1～5］。

1 大黄素对血液系统肿瘤的影响

Kawai等首先发现，大黄素能够抑制鼠白血病L1210细胞的生长，随后发现大黄素对多种肿瘤细胞的增殖均有抑制作用［6］。人类红白血病细胞系K562是由Lozzio等于1975年从1例处于原始细胞危象的慢性髓系白血病患者的胸腔渗出液中建立的，因其具有费城染色体（Ph）及bcr/abl融合基因，常被用于CML的体外研究。现代研究证明很多中药有不同程度抗肿瘤作用，中药以其攻补兼施，毒副反应小或无，注意整体的优越性而在肿瘤治疗中得到广泛认可或重视［7］。Mcgahon等［8］研究发现，K562细胞对多种化疗药物诱导的凋亡有很强的抵抗性，这种抗凋亡的机制可能与CML特征性bcr/abl融合基因所表达的P210bcr/abl融合蛋白具有很强的酪氨酸激酶（TK）活性有关［9］。有研究证明，大黄素对小鼠P338白血病有抑制作用。黄绿叶等［10］的实验证实，大黄素能有效抑制HL60细胞增殖，将细胞阻滞于G0/G1期，诱导其凋亡。连晓岚等［11］研究发现大黄素能抑制U937细胞增殖。大黄素作用后克隆形成率下降，出现亚二倍体峰及DNA片段化，细胞阻滞在 G0/G1期；bcl－2/bax的比值降低；CPP32活化，这些可能参与了大黄素抑制U937细胞增殖和诱导凋亡的过程。

2 近年来的实验研究

2.1 大黄素对于K562细胞基因表达的影响 张丛丛［12］通过流式细胞仪检测，酶标仪检测caspase3/7活性，RT－PCR检测bcl－2、NF－κB的表达，发现大黄素能抑制K562细胞生长并具有浓度依赖性，对K562细胞的IC50为51.58μmol/L，大黄素处理后，K562细胞主要表现为S期细胞增多、G0/G1期及G2/M 期细胞减少（P＜0.05）；U937细胞主要表现为G0/G1期细胞增多、G2/M期及S期细胞减少（P＜0.05）。两种细胞的凋亡率也随浓度的增加而增加（P＜0.05）。大黄素处理后 K562细胞内的caspase3/7酶活性增加，与对照组相比有显著性差异（P＜0.05）。经过大黄素处理后K562细胞内的bcl－2、NF－κB的表达均较对照组下调。

胡建达［13］等应用 MTT、DNA片段化分析及TdT酶介导的末端缺失原位标记法检测大黄素对K562细胞增殖及凋亡的影响；RT－PCR检测大黄素对K562细胞bcl/abl、mdr－1基因 mRNA表达的影响，免疫印迹实验法检测大黄素对K562细胞bcr/abl融合蛋白P210表达的影响。结果发现大黄素能有效抑制K562细胞的增殖作用72h的半数抑制浓度（IC50）为20μmol/L并能诱导其凋亡，随药物作用浓度的增加，凋亡率也逐渐上升，大黄素下调K562细胞bcl/abl、mdr－1基因 mRNA 的表达，也下调了K562细胞P210蛋白的表达。

2.2 大黄素对于K562细胞生长周期的影响 郑志宏［14］等通过采用MTT法、集落形成试验观察大黄素对K562增殖的影响、Annexin VFITC/PI法、DNA倍体分析及DNA凝胶电泳法检测细胞凋亡，Westernblot检测大黄素作用后不同时间段P210、磷酸化P210、caspase23前体蛋白及PARP表达水平的变化发现，大黄素作用K562细胞后，随大黄素浓度增大，细胞增殖抑制越明显，呈剂量依赖性；随时间的延长，大黄素对K562细胞的抑制率也逐渐升高，呈时间依赖性。大黄素处理K562细胞48h半数抑制浓度（IC50）为38.25μmol/L。大黄素作用K562细胞24h后，随着药物浓度的增加，细胞凋亡率主要以早期凋亡为主，并逐渐增加。大黄素作用48h后即可见亚二倍体G1峰（凋亡峰）的出现，凋亡率为9.12%；随药物浓度的增大，凋亡率升高，40及80μmol/L大黄素作用的凋亡率分别为25.33%及34.92%。

张旭霞［15］等采用MTT法测定细胞的增殖抑制率，实验组、对照组和药物试验组应用荧光染色法观察不同浓度大黄素作用后细胞形态的改变判定凋亡效果，DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞内DNA的损伤程度，流式细胞仪分析细胞周期变化，RT－PCR法检测大黄素作用前、后c－myc mRNA表达水平的变化发现大黄素对K562细胞具有明显的抑制作用，并呈浓度和时间依赖性（P＜0.01），其96h半数抑制浓度（IC50）约为53.28μmol/L。大黄素作用96h后，荧光显微镜下可见细胞核不规则，核碎裂呈新月形改变，DNA琼脂糖凝胶电泳显示，基因组DNA显现典型的凋亡细胞的梯状图谱。流式细胞仪检测可见大黄素影响细胞周期，细胞阻滞于G0/G1期。RT－PCR法检测显示c－myc基因表达减弱（P＜0.01），100μmol/L大黄素作用后表达强度较对照组减少54%。并认为大黄素能有效抑制K562细胞增殖并诱导其凋亡，其作用机制可能是使细胞受阻于G0/G1期而进入凋亡程序，c2myc表达降低可能是大黄素诱导白血病细胞凋亡重要途径之一。

金丹婷［16］等通过 MTT、流式细胞术、Caspase检测等方法观察大黄素对K562细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用发现大黄素能显著抑制K562细胞的增殖，作用24、48、72h后的半数抑制率浓度分别为80、50、40μmol/L；处理组细胞在普通光镜下可见典型的凋亡形态学改变；Annexin V/PI双标记法检测到K562细胞在大黄素的诱导下出现早期凋亡并呈剂量依赖性（P＜0.01）；流式细胞仪结果分析发现，处理组的K562细胞被阻滞于G0/G1期，与对照组相比，凋亡率明显升高并呈现剂量依赖性（P＜0.01）；大黄素可触发Caspase－3、8、9的活性增高（P＜0.01）。

2.3 大黄素对K562细胞蛋白合成的影响 郑志宏［17］应用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测大黄素对K562/Adr细胞增殖的影响；DNA片段化分析、AnnexinⅤ细胞凋亡检测、DNA倍体分析及TdT酶介导的末端缺失原位标记（TUNEL）法检测大黄素对K562/Adr细胞凋亡的影响；RT－PCR法检测大黄素作用前后 K562/Adr细胞c－myc、bcr/abl、mdr－1基因 mRNA 表达的影响；Western blotting法检测大黄素对K562/Adr细胞c－myc蛋白、bcr/abl融合蛋白P210表达的影响及大黄素作用后HL－60、K562/Adr细胞Akt信号通路蛋白表达水平的变化，发现：（1）大黄素能有效抑制K562/Adr细胞的增殖，作用72h的IC50约为20μmol/L，并能诱导其凋亡，随药物作用浓度的增加，凋亡率也渐上升。（2）大黄素下调 K562/Adr细胞c－myc、bcr/abl、mdr－1基因 mRNA 的表达；也下调了 K562/Adr细胞c－myc、P210蛋白的表达。（3）大黄素下调HL－60、K562/Adr细胞 Akt信号通路蛋白 Akt、p－Akt、IκB－α、p－IκB－α、p65、p－p65、mTOR、p－mTOR的表达。发现：（1）大黄素能有效抑制K562/Adr细胞增殖，诱导其凋亡；并可能通过下调c－myc、bcr/abl和mdr－1的表达起作用。（2）Akt信号通路参与了大黄素抑制HL－60、K562/Adr细胞增殖、诱导凋亡的过程。

3 结语

许多研究已证实大黄素具有广泛的药理学作用，包括抑制胰酶作用、抗氧化及清除氧自由基、抗炎抑菌及免疫调节作用、肝肾保护作用及抗肿瘤作用等。特别是大黄素具有的抗肿瘤活性使它备受关注，它的抗肿瘤机制也成为研究的热点。许多对化疗药已不敏感的肿瘤细胞对大黄素还存在一定的敏感度，这就为以后的抗肿瘤治疗提供了新的前景，但仍有待进一步深入研究，如体外研究多，体内研究少；诱导凋亡、分化的研究大部分停留在对现象的观察及个别指标的检测上；逆转MDR的研究作用靶点较单一，要与现代细胞与分子生物学结合起来进一步探明其作用机制和靶点。如何从多层次、多学科对其抗肿瘤作用机理进行具体化、客观化、定性定量的研究，以进一步揭示其奥秘，尚有待医学科研工作者不断努力。

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