穿梭蛋白核仁素的多种生物学功能

贺 欣(综述)，宋娜玲，孟爱民(审校)

(北京协和医学院，中国医学科学院放射医学研究所，天津市分子核医学重点实验室，天津 300192)

穿梭蛋白核仁素的多种生物学功能

贺 欣(综述)，宋娜玲，孟爱民※(审校)

(北京协和医学院，中国医学科学院放射医学研究所，天津市分子核医学重点实验室，天津 300192)

核仁素(又称C23)是一段进化保守的核仁-胞质-细胞膜穿梭蛋白，是真核细胞核仁中含量最丰富的蛋白之一;它含有三个结构域，具有多种配体结合活性，在调控细胞分化、增殖、胚胎发生、核糖体合成与成熟、细胞凋亡、病原体侵袭等方面发挥着广泛的生物学功能。在此根据核仁素在细胞内和细胞膜两种物理定位分为两个方面分别介绍其发挥的生物学活性和与其结合的相应配体，揭示特异性干涉其活性的途径。

核仁素/C23;穿梭蛋白;配体;个性化治疗

核仁素(又称C23)是核仁中含量最丰富的非核糖体蛋白之一，由于其含有丰富的带负电荷的酸性残基，它在电泳迁徙中表现出的条带在相对分子质量110 000附近。该蛋白在脊椎动物中高度保守，在植物和酵母中也存在类似物。核仁素是一种穿梭蛋白，也是一种DNA/RNA结合蛋白，在不同类型的细胞，或者相同类型细胞的不同分化阶段，它可能存在于不同部位。它在核仁，胞质和一部分细胞的细胞表面通过多种机制发挥着广泛的生物学功能，包括调控核糖体的生物合成与成熟，调控细胞增殖、生长、胚胎发生、胞质分裂、染色质复制与核仁的发生，促进细胞增殖，抗细胞凋亡，协助病原体侵袭等作用。

核仁素主要有三个结构域：N端结构域存在核定位信号(nuclear localization signal，NLS)，富含酸性残基，含有酪蛋白激酶2和细胞周期蛋白依赖性激酶1的多个磷酸化位点;中央域包含4个RNA识别基序(RNA recognition motifs，RRM)，又称为 RNA 结合结构域(RNA binding domain，RBD);C-末端富含甘氨酸和精氨酸(Gly/Arg-rich，GAR)。核仁素的结构特点赋予其多种配体结合活性，从而发挥了广泛的生物学功能，下面将分两个方面介绍核仁素的结合特性以及其发挥的功能。

1 细胞内的核仁素发挥的功能及其配体

1.1 组蛋白分子伴侣活性核仁素氨基端含有由4个酸性α螺旋，酸性基团与组蛋白通过离子键相互作用赋予核仁素组蛋白分子伴侣(histone chaperone)活性。核仁素在促进RNA转录，染色质模板的动态组装方面具有重要作用。染色质组装有两个重要步骤：H3-H4四聚体组装和其之后的两个H2A-H2B二聚体的组装，核仁素与H2A-H2B二聚体直接结合形成可溶的稳定的结合物，从而帮助核小体在裸DNA上的组装，核仁素在组蛋白装配过程中发挥的效果从数量上和质量上都接近于另外两个明确特征的组蛋白分子伴侣：核质蛋白(nucleoplasmin)和核小体装配蛋白1(nucleosome assembly protein-1，NAP-1)。

1.2 促进核糖体转录，装配和成熟活性 核仁素中心区RBD和交替排列的疏水与亲水结构可与pre-rRNA结合形成茎环结构(stem-loop structure)，并与其他核糖核蛋白一起形成一个大的剪接复合体。核仁素羧基端富含甘氨酸残基并散在分布着二甲精氨酸与苯丙氨酸。该结构不仅可以减少碱的堆积和 RNA二级结构的形成，还有利于RNA接近RBD结构，有利于核仁素对RNA的识别、包裹及转运。核仁素通过识别、包裹pre-rRNA从而促进原初转录产物45S rRNA剪接并断裂，生成成熟的rRNA(18S，28S，5.8S)。

1.3 参与基因转录调节 核仁素具有DNA结合并与其他蛋白共同作用参与基因转录调节的活性。核仁素参与结合Emu基因增强子并进一步调节转录;核仁素能与核糖核蛋白C共同结合于前淀粉酶基因的启动子并介导前淀粉酶基因的转录;在对造血干细胞增殖机制的基础理论研究中发现，核仁素对C基因起转录激活作用［1］;核仁素通过抑制p53依赖途径保持胚胎干细胞的自我更新［2］，为进一步研究核仁素作为干细胞生长因子的可能性奠定基础。

另外，核仁素直接参与MicroRNAs合成［3］，核仁素的细胞定位和水平与miR-15a/16水平直接相关。

1.4 促细胞增殖和抗细胞凋亡活性 核仁素通过其RBD与多种凋亡相关基因的mRNA的5'和3'UTR结合，使相应的mRNA稳定或去稳定，从而起到促进细胞增殖和抗细胞凋亡作用。

1.5 穿梭特性 作为一种非组胺磷酸蛋白，核仁素通过N端结构域存在核定位信号，另外，其中心区的RBD和羧基端GAR区与核仁其他结构(蛋白质和RNA)的共价结合，也对其稳定存在于真核细胞核仁的致密纤维组分与颗粒区作出了贡献。Huang等［4］发现血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)以及Ecm成分可以促使核仁素从胞质向胞膜转运。细胞周期依赖性激酶2诱导核仁素N端区域丝氨酸苏氨酸的磷酸化促使其向胞质移位;相反，去磷酸化则促进其向核转位［5］。目前核仁素的穿梭机制尚未完全明了，从核仁向胞质移位的过程依赖于完整的细胞骨架和非肌肉肌球蛋白重链9(nonmuscle myosin heavy chain 9，MyH9)，MyH9 作为细胞膜表面核仁素与细胞骨架之间的生理连结者，从而促进核仁素在细胞内的移位。MyH9基因剔除和MyH9过表达突变均能明显抑制核仁素的细胞膜定位和新生血管的生成［4］。也有研究［6］认为核仁素的转运可能与p53的激活有关，当细胞受到刺激后，可即刻诱导核仁素和p53复合物的形成。

核仁素的这种穿梭特性，一方面使其作为一种载体，携带核糖体蛋白质转入细胞核和核仁，完成核糖体亚单位的组装;另一方面能够将组装好的核糖体亚单位从细胞核运出至细胞质。

2 细胞膜核仁素发挥的功能及其配体

在Hela(宫颈癌细胞)细胞中，胞质核仁素以囊泡形式转位到膜表面，与配体结合后向细胞核转运［7］;利用双重免疫荧光染色法发现核仁素和肌动蛋白共定位于细胞膜表面，并且发现细胞松弛素D(肌动蛋白聚合特异性抑制剂)能明显影响核仁素在HeLa细胞膜表面的定位;核仁素的膜定位与温度亦存在一定的关系，在37℃时细胞膜表面核仁素的表达明显增加，但在室温或5℃时则减少。多位研究者在多种肿瘤细胞(如肝癌细胞、白血病细胞、乳腺癌细胞、横纹肌肉瘤、淋巴瘤细胞等)，免疫细胞(如人T、B细胞和单核-巨噬细胞系统等)以及正常细胞(如血管内皮细胞、神经细胞、喉上皮细胞、肌肉、大鼠心肌细胞、鼠睾丸细胞、小鼠肌原细胞、小鼠巨噬细胞等)的细胞膜表面发现核仁素的存在。

核仁素以磷酸化的形式存在于细胞膜表面，作为许多不同配体的细胞表面受体，包括生长因子(即碱性成纤维细胞生长因子)和趋化因子(即中期因子)。

2.1 介导抗血管生成和抗肿瘤作用 最近的研究显示，肿瘤细胞表面的核仁素可作为多种配体的受体，与相应配体结合介导相应的肿瘤生物学行为。在正常肝细胞中，核仁素只表达于细胞核内，呈点状阳性;在肝癌细胞中表达量增加，且表达模式发生了变化，提示核仁素在肝细胞癌发生中起了重要作用［8］。

Christian等［9］发现核仁素可以作为新生成血管内皮细胞的表面标志物。通过对核仁素的功能阻止和表达下调，可以抑制内皮细胞的迁徙和毛细血管的形成。Acharan sulfate(AS)具有抗血管生成、抗凝血、抑制细胞分裂、免疫调节功能以及抗肿瘤等效应。Kim等［10］利用生物素标记路易肺癌(Lewis lung carcinoma，LLC)细胞，AS亲和层析分离细胞裂解物，通过质谱和Western-blot技术从AS的细胞膜结合蛋白中筛选到核仁素，提示AS通过与细胞膜表面核仁素结合，在细胞膜内吞作用下进入细胞质，进一步触发细胞内通信而发挥生物学效应。

Legrand等［11］通过研究发现乳铁蛋白亦可以与细胞膜表面核仁素结合并内吞入靶细胞内。最近，Shi等［12］报道内皮抑素(endostatin)的抗血管生成和抗肿瘤作用由细胞表面的核仁素介导。内皮抑素与肿瘤细胞和周边血管内皮细胞表面的核仁素高亲和力结合。核仁素和内皮抑素可在肿瘤组织血管内皮细胞表面共显色;阻断细胞表面核仁素会导致内皮抑素失去其抗血管生成活性。

Porkka等［13］报道在体外和体内实验表明肿瘤归巢肽F3与核仁素结合，进一步内化到肿瘤细胞和肿瘤血管内皮细胞核内。Drecoll等［14］采用F3二聚体携带α粒子发射体213Bi，通过F3与血管肿瘤细胞表面的核仁素高亲和力结合使得213Bi-DTPA-［F3］2在肿瘤细胞核聚集(体外实验)，在腹腔肿瘤聚集(体内试验)，对腹膜癌起到有效的治疗作用，采用213Bi-DTPA或者PBS处理的荷瘤鼠平均生存时间为51 d和53 d，而213Bi-DTPA-［F3］2 处理的荷瘤鼠平均生存时间为93.5 d，有显著性差异。

富含鸟嘌呤寡核苷酸(G-rich oligonucleotides，GROs)通过分子间和分子内作用形成四链或者四联体结构，该结构与靶点通过形状特异识别结合，类似于抗原抗体结合，从而发挥不同寻常的生物物理和生物特性。GROs可能的靶点之一便是肿瘤细胞及周边血管细胞表面的核仁素。人工合成的活性GROs作为适体(aptamers)可参与治疗多种人类疾病。AS1411［15］作为 GROs类的典型代表，目前已经进入肿瘤治疗的Ⅱ期临床研究。作为治疗药物，GROs具有许多超越于单克隆抗体或其他寡核苷酸治疗途径的优点，例如无免疫原性，热稳定性良好，对血清核酸酶稳定，细胞摄取率高等。

2.2 协助病原微生物感染 人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染靶细胞时首先通过包膜糖蛋白gp120-gp41黏附到宿主细胞膜上的受体复合物CD4分子和趋化因子受体家族(CXCR4/CCR5)，进而与靶细胞膜融合，使HIV病毒进入宿主细胞。近年来研究表明，多种配体通过与细胞膜表面的核仁素结合而抑制HIV感染。Said等［16］利用激光共聚焦显微镜发现核仁素与生长因子Midkin(MK)、Pleiotrophin(PTN)共定位于细胞膜上，并且生长因子MK和PTN以细胞膜上的核仁素为低亲和力受体，进而发挥其抗HIV感染的作用。

Nisole等［17］发现一种抗艾滋病假肽代号为HB-19可与细胞膜上的核仁素结合形成不可逆的复合物，进而抑制HIV通过核仁素黏附到宿主细胞上，运用各种突变体进一步证实HB-19的结合位点在核仁素羧基端区域的GAR结构区。

这些研究表明，细胞膜表面核仁素可能作为HIV黏附的共受体在HIV的致病机制中发挥重要作用，而这些与胞膜核仁素结合的配体则可能是潜在的抗HIV感染抑制剂。

除了HIV以细胞膜上的核仁素为受体外，其他如腺病毒伴随病毒2(adeno associated virus-2，AAV-2)、副流感病毒(human parainfluenza virus-3，HPIV-3)、柯萨奇B病毒以及肠出血大肠埃希菌均可以细胞膜上的核仁素为共受体，完成对宿主细胞的黏附与在宿主体内的定植。肠出血大肠埃希菌O157：H7表达的外膜蛋白Intimin-γ与喉上皮细胞膜定位的核仁素结合后可以促进细菌定植基座的形成，同时用抗核仁素抗体预处理后能明显抑制细菌黏附。核仁素与丁型肝炎抗原氨基末端相互作用可调节丁型肝炎病毒复制。

2.3 调节免疫反应 Hirano等［18］发现凋亡早期的Jurkat细胞(T淋巴细胞)表面CD43分子包含的多糖链可作为一种配体分子与人单核细胞膜表面的核仁素结合，从而激活人单核细胞对Jurkat细胞的识别与吞噬。抗CD43抗体、抗核仁素抗体、寡糖链预处理人单核细胞后均可以抑制人单核细胞对早期凋亡细胞识别与吞噬。人单核细胞膜表面核仁素参与介导脂多糖所致早期炎性介质白细胞介素 1β(interleukin-1β，IL-1β)和肿瘤坏死因子 α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的表达与分泌［19］，促进脂多糖所致的 IL-1β 释放［20］。

L-选择素在调控白细胞以及白细胞与血管内皮细胞黏附中起重要作用，利用亲和层析法和质谱技术从白细胞和造血祖细胞膜蛋白中筛选出核仁素作为L-选择素配体之一。核仁素通过L-选择素参与调控白细胞之间及其与血管内皮细胞之间的黏附。

Jurkat细胞、U937(单核细胞)细胞膜表面核仁素可与补体抑制剂(factor J)特异性结合，之后被内翻入细胞内，从而调节细胞之间的黏附。核仁素抗体可以抑制Jurkat细胞与factor J之间的黏附;同时也发现核仁素与factor J结合后，细胞内一些酪氨酸蛋白的磷酸化也明显增加，提示factor J对细胞黏附能力的调节依赖于细胞膜表面核仁素及随后酪氨酸蛋白的磷酸化。

2.4 介导神经分化和发育 层粘连蛋白(laminin)所包含的IKVAV序列能够和细胞膜上的核仁素结合，从而参与调控原始神经细胞和其他神经细胞的分化;并且核仁素在成熟的大脑和分化的神经细胞有较高的浓度，提示核仁素在神经组织的分化中起重要作用。

Caudle等［21］发现在帕金森病细胞模型中，核仁素与帕金森症发展进程中的两个关键蛋白α-synuclein和DJ-1存在相互作用。最近研究表明，核仁素在人帕金森病患者黑质致密体中与正常对照组相比显著减少。在帕金森病体外模型中，控制核仁素可导致鱼藤酮处理之后的氧化应激和蛋白酶体抑制的显著改变。有趣的是，核仁素表达并不影响线粒体复合物Ⅰ的活性，表明存在其他的特异性氧化应激和蛋白酶体途径。

3 结语

作为一种多功能穿梭蛋白，核仁素众多生物学功能的机制尚未被完全了解，而其具有的潜在生物学意义或许还有很多未被发现;对它的研究将涉及微生物学、免疫学、细胞生物学等多学科领域。以核仁素为切入点的治疗策略正在为疾病尤其是肿瘤的个性化治疗带来新的希望。

［1］林忆华.核仁素转录激活子功能研究［J］.中国药师，2009，12(8)：1010-1014.

［2］Yang A，Shi G，Zhou C，et al.Nucleolin maintains embryonic stem cell self-renewal by suppression of the p53-dependent pathway［J］.J Biol Chem，2011，286(50)：43370-43382.

［3］Pickering BF，Yu D，Van Dyke MW.Nucleolin interacts with the microprocessor complex to affect microRNAs 15a and 16 biogenesis［J］.J Biol Chem，2011，286(51)：44095-44103.

［4］Huang Y，Shi H，Zhou H，et al.The angiogenic function of nucleolin is mediated by vascular endothelial growth factor and nonmuscle myosin［J］.Blood，2006，107(9)：3564-3571.

［5］lliakis G，Krieg TJ.Evidence for an S-phase checkpoint regulating DNA replication after heat shock［J］.Int J Hyperthemfia，2004，20(2)：240-249.

［6］Daniely Y，Dimitrova D，Borowiec，J.Stress-dependent nucleolin mobilization mediated by p53-nucleolin complex formation［J］.Mol Cell Biol，2002，22(16)：6014-6022.

［7］Hovanessian AG，Puvion-Dutilleul F，Nisole S，et al.The cell-surface-expressed nucleolin is associated with the actin cytoskeleton［J］.Exp Cell Res，2000，261(2)：312-328.

［8］蒙国照，肖胜军，曾思恩，等.细胞表面核仁素表达下调抑制肝癌细胞生长［J］.中华肿瘤杂志，2011，33(1)：23-27.

［9］Christian S，Pilch J，Akerman ME，et al.Nucleolin expressed at the cell surface is a marker of endothelial cells in angiogenic blood vessels［J］.J Cell Biol，2003，163(4)：871-878.

［10］Joo EJ，ten Dam GB，van Kuppevelt TH，et al.Nucleolin：acharan sulfate-binding protein on the surface of cancer cells［J］.Glycobiology，2005，15(1)：1-9.

［11］Legrand D，Vigié K，Said EA，et al.Surface nucleolin participates in both the binding and endocytosis of lactoferrin in target cells［J］.Eur J Biochem，2004，271(2)：303-317.

［12］Shi H，Huang Y，Zhou H，et al.Nucleolin is a receptor that mediates antiangiogenic and antitumor activity of endostatin［J］.Blood，2007，110(8)：2899-2906.

［13］Porkka K，Laakkonen P，Hoffman JA，et al.A fragment of the HMGN2 protein homes to the nuclei of tumor cells and tumor endothelial cells in vivo［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2002，99(11)：7444-7449.

［14］Drecoll E，Gaertner FC，Miederer M，et al.Treatment of peritoneal carcinomatosis by targeted delivery of the radio-labeled tumor homing peptide bi-DTPA-［F3］2 into the nucleus of tumor cells［J］.PLoS One，2009，4(5)：e5715.

［15］Bates PJ，Laber DA，Miller DM，et al.Discovery and development of the G-rich oligonucleotide AS1411 as a novel treatment for cancer［J］.Exp Mol Pathol，2009，86(3)：151-164.

［16］Said EA，Courty J，Svab J，et al.Pleiotrophin inhibits HIV infection by binding the cell surface-expressed nucleolin［J］.FEBS J，2005，272(18)：4646-4659.

［17］Nisole S，Said EA，Mische C，et al.The anti-HIV pentameric pseudopeptide HB-19 binds the C-terminal end of nucleolin and prevents anchorage of virus particles in the plasma membrane of target cells［J］.J Biol Chem，2002，277(23)：20877-20886.

［18］Hirano K，Miki Y，Hirai Y，et al.A multifunctional shuttling protein nucleolin is a macrophage receptor for apoptotic cells［J］.J Biol Chem，2005，280(47)：39284-39293.

［19］方立，王慷慨，蒋磊，等.膜表面核仁素对脂多糖所致TNF-α和IL-1β 表达的影响［J］.中南大学学报：医学版，2008，11(33)：999-1004.

［20］张彬，肖献忠，张文辉，等.核仁素对LPS诱导的白细胞介素1β释放的影响［J］.中国病理生理杂志，2010，26(9)：1796-1800.

［21］Caudle WM，Kitsou E，Li J，et al.A role for a novel protein，nucleolin，in Parkinson's disease［J］.Neurosci Lett，2009，459(1)：11-15.

Biological Functions of Shuttling Protein—Nucleolin

HE Xin，SONG Na-ling，MENG Ai-min.(Institute of Radiation Medicine of Chinese Academy of Medical Sciences＆Peking Union Medical College，Tianjin Key Laboratory of Molecular Nuclear Medicine，Tianjin300192，China)

Nucleolin(also called C23)is a highly-conserved protein which can shuttle between nucleus，cytoplasm and cell membrane，one of the most abundant proteins in nucleus;it can bind to various ligands with its three domains，modulating a wide range of biological functions such as cell differentiation，cell proliferation，embryogenesis，ribosome synthesis and maturity，apoptosis，pathogens invasion and so on.Here，we foucus on its functions and the corresponding ligands inside and outside of the cell，revealing ways of specifically interfering its activities.

Nucleolin/C23;Shuttling protein;Ligands;Personalized treatment

R34

A

1006-2084(2012)13-1961-04

中国医学科学院放射医学研究所发展基金(SF1004)

2011-10-26

2011-12-26 编辑：潘雪